梵凈山紫蘇紫蘇醛的提取及其含量分析

譚善財(cái) 袁波 黃珍

摘要 [目的]利用高效液相色譜測定梵凈山4種紫蘇（FMPF）莖、葉、果萼和籽4個(gè)部位中紫蘇醛含量。[方法]在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以甲醇為提取劑，紫蘇醛提取率為響應(yīng)值，對料液比、提取時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。其他固定條件為超聲提取溫度35 ℃，提取1次，頻率40 kHz， 功率300 W。以最佳條件提取、高效液相色譜測定4種紫蘇4個(gè)部位中紫蘇醛。[結(jié)果]最優(yōu)條件：料液比1∶60、提取時(shí)間24 min；同一紫蘇莖、葉、果萼、籽中紫蘇醛含量均有顯著差異（P<0.05），葉>果萼>莖>籽；4種紫蘇葉、果萼紫蘇醛含量差異顯著（P<0.05）；FMPF1（葉闊卵形、兩面紫色、邊緣鋸齒淺）和FMPF4（葉卵形、兩面紫色、具狹而深鋸齒）紫蘇葉中紫蘇醛含量分別為7.537和6.139 mg/g，果萼中的含量分別為3.712和3.887 mg/g。[結(jié)論]梵凈山紫蘇（FMPF1、FMPF4）是提取紫蘇醛的優(yōu)質(zhì)資源，同時(shí)提示紫蘇醛含量與葉型具有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 梵凈山；紫蘇；紫蘇醛；不同部位；響應(yīng)面法

中圖分類號 R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）08-0174-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.046

Abstract [Objective] The content of perillaldehyde in stems，leaves，fruit calyx and seeds of four kinds of Perilla frutescens from Fanjin Mountain （FMPF） was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.[Method]Based on the single factor test results，taking methyl alcohol as the extraction solvent，solidliquid ratio and extraction time were considered for the further optimized using response surface method （RSM） when perillaldehyde content（PAC）was used as response.And other ultrasonic conditions were fixed for extraction temperature 35 ℃，times of 1，frequency 40 kHz，power 300 W.Perillaldehyde from four parts of P.frutescens were extracted under optimal conditions and determined by HPLC.[Result] The optimum conditions were obtained as follows：solidliquid ratio 1∶60，extraction time 24 min.PAC in stems，leaves，fruit calyx and seeds of the same P.frutescens were significantly differences （P<0.05），leaves>fruit calyx>stems>seeds.PAC in leaves or fruit calyx between 4 kinds of P.frutescens also had significant differences （P<0.05），and PAC in leaves of FMPF1（broad ovate，purplish on both sides leaves and its margin is shallow sawtooth）or FMPF4（ovate，purplish on both sides leaves and its margin is deep sawtooth）were 7.537 and 6.139 mg/g，respectively，and PAC of their fruit calyx is 3.712 and 3.887 mg/g，respectively.[Conclusion] The P.frutescens （FMPF1，F(xiàn)MPF4） from Fanjing Mountain is a good resource for extracting perillaldehyde.Simultaneously，it is suggested that there is a correlation between leaf morphology and PAC.

Key words Fanjing Mountain；Perilla frutescens；Perillaldehyde；Different parts；Response surface method

紫蘇 （Perilla frutescens）屬于唇形科紫蘇屬一年生草本植物，有1種3變種，分別為紫蘇原變種、野生紫蘇、耳齒紫蘇、回回蘇，其葉、莖、籽均可入藥[1-2]。紫蘇醛是一種單萜類化合物，是紫蘇葉揮發(fā)油的主要成分和特征香氣成分，廣泛地應(yīng)用于食用香料配方和日用香精配方[3]?！吨袊幍洹芬?guī)定：紫蘇葉應(yīng)使用紫蘇醛型藥材，藿香正氣口服液的紫蘇葉揮發(fā)油中紫蘇醛的含量不低于25%；日本藥局方規(guī)定紫蘇葉中紫蘇醛的含量不得少于0.08%?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)表明，紫蘇醛具有抗衰老、降血脂、抗炎癥、抗抑郁、增強(qiáng)免疫、抑菌抗腫瘤等功能[4-11]?？梢姡咸K醛是紫蘇葉揮發(fā)油中主要的一種活性物質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 利用Design-Expert 8.0 軟件對紫蘇醛提取率進(jìn)行多元回歸擬合分析，不同紫蘇中紫蘇醛組間顯著差異分析采用軟件 SPSS 15.0 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品溶液中紫蘇醛的確定

基于“1.2.1.2”HPLC色譜條件，對比紫蘇醛對照品和紫蘇葉樣品溶液色譜峰的保留時(shí)間（圖2）可知，紫蘇醛的保留時(shí)間為 6.023 min。該試驗(yàn)流動相為甲醇∶水=78∶22，流速1.0 mL/min，與文獻(xiàn)[13] 乙腈水 （體積比75∶25，流速0.5 mL/min，紫蘇醛保留時(shí)間為 6.576 min）、文獻(xiàn)[14]甲醇水 （體積比72∶28，流速1.3 mL/min，紫蘇醛保留時(shí)間為 13.10 min，）做流動相相比，該方法快速、成本低、毒性小。

2.2 紫蘇葉中紫蘇醛提取條件的優(yōu)化

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。以紫蘇醛對照品的質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=36.181X-8.120 9（R2=0.999 7，n=7），表明濃度在5.76～368.64 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2.2 方法學(xué)考察。精密吸取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，紫蘇醛峰面積RSD為0.79%，可見儀器精密度較高；同一樣品溶液，分別于2、4、8、16、24、48 h測定，紫蘇醛峰面積RSD為1.07%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；向5個(gè)1.0 mL已知濃度的樣品溶液分別加入3、6、12、24、48 μL對照品儲備液，測得平均回收率為99.74%，RSD為1.05%。

2.2.3 單因素試驗(yàn)。

參照《中國藥典》（2015版），選擇甲醇為提取劑，超聲輔助提取，考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)4個(gè)因素對紫蘇醛提取率的影響。如圖3所示，當(dāng)溫度從25 ℃上升至35 ℃時(shí)，紫蘇醛的提取率明顯增加，在35～55 ℃，提取率沒有明顯變化，考慮節(jié)省成本，設(shè)定溫度為35 ℃；在提取時(shí)間5～15 min，提取率不斷增加，隨著時(shí)間的延長，提取率變化不明顯；料液比對紫蘇醛提取的作用，與提取時(shí)間對提取率的影響有類似的變化規(guī)律；隨著提取次數(shù)的增加，提取率顯著下降，第1次提取紫蘇醛得率為95.31%，因此選擇提取1次。

試驗(yàn)結(jié)果表明，提取溫度在35～55 ℃對紫蘇醛提取率影響不大，第1次提取得率為95.31%，所以確定提取溫度為35 ℃，提取次數(shù)為1次。料液比和提取時(shí)間對紫蘇醛提取率有較大的影響，因此確定料液比和提取時(shí)間2個(gè)單因素為響應(yīng)分析待優(yōu)化因素。

2.2.4 提取條件優(yōu)化。

利用CCD設(shè)計(jì)法，以料液比（A）和提取時(shí)間（B）2個(gè)單因素為待優(yōu)化因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，方案與結(jié)果如表2所示。

利用Design-Expert 8.0 軟件對表2中紫蘇醛提取率數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得出二次回歸方程為Y=7.15-2.34×10-3A-0.013B+8.28×10-4AB-7.58×10-5 A2-1.03×10-4 B2。方程方差分析結(jié)果表明，該模型具有顯著性（P<0.01），且失擬項(xiàng)不顯著 （P=0.095 0），說明該模型適宜；決定系數(shù)R2=0.931 1，表明方程相關(guān)性良好；變異系數(shù)為0.72%，說明試驗(yàn)操作穩(wěn)定，模擬方程能較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。B、AB兩項(xiàng)P<0.05，說明提取時(shí)間、提取時(shí)間和料液比的交互作用對紫蘇醛提取有顯著的影響。

圖4是根據(jù)回歸方程繪出的以紫蘇醛為響應(yīng)值、提取時(shí)間和料液比對紫蘇醛提取效率影響的響應(yīng)曲面。 通過分析，紫蘇醛提取的最佳條件是：料液比1∶57.9，提取時(shí)間23.6 min，在此條件下，提取率可達(dá)7.511 mg/g。根據(jù)實(shí)際情況，以料液比1∶60、提取時(shí)間24 min，其他條件與優(yōu)化設(shè)計(jì)方案中一致，平均提取3次，對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)值達(dá)7.517 mg/g，與響應(yīng)面優(yōu)化得到的方程理論預(yù)測值相吻合。

從單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的結(jié)果可以得出，以甲醇為提取劑，紫蘇醛提取率為響應(yīng)值，超聲（頻率40 kHz，功率300 W）輔助提取的最佳條件為提取溫度35 ℃、時(shí)間24 min、料液比1∶60、提取1次。

2.3 4種紫蘇及其不同部位紫蘇醛含量的比較 采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取條件，對4種紫蘇（FMPF1、FMPF2、FMPF3、FMPF4）莖、葉、果萼和籽4個(gè)部位中紫蘇醛進(jìn)行提取。結(jié)果表明（表3），同一紫蘇莖、葉、果萼、籽中紫蘇醛含量均有顯著差異（ P<0.05），且葉>果萼>莖>籽，主要集中在葉和果萼中，籽中含量極少；4種紫蘇葉、果萼的紫蘇醛含量差異顯著（P<0.05），F(xiàn)MPF1、FPF4紫蘇葉中紫蘇醛含量分別為7.537和6.139 mg/g，果萼中的含量分別為3.712和3.887 mg/g。因此，僅從紫蘇醛的含量用藥來考慮，可憑紫蘇葉的外部形態(tài)來判斷，F(xiàn)MPF1和FMPF4最佳，F(xiàn)MPF2、FMPF3次之；用藥部位選擇葉最理想，果萼次之。

魏長玲等[15]對河南、河北、重慶、安徽、四川、甘肅等國內(nèi)紫蘇主產(chǎn)地區(qū)43份樣品葉中紫蘇醛檢測顯示，其中21份沒有檢測到紫蘇醛；張琛武[16]對38份樣品葉中紫蘇醛進(jìn)行檢測，僅4份樣品檢測到紫蘇醛，同時(shí)對9種含紫蘇醛的紫蘇葉檢測顯示，各種質(zhì)的紫蘇醛平均含量在0.5 ～ 3.0 mg/g，最高含量為6.6 mg/g；耿榕徽等[13]利用不同方法提取河北承德紫蘇葉中紫蘇醛，檢測結(jié)果紫蘇醛最高含量為3.89 mg/g。該研究顯示梵凈山紫蘇葉中紫蘇醛平均含量在1.848 ～7.537 mg/g，果萼中平均含量在0.554 ～3.887 mg/g?？梢婅髢羯阶咸K（FMPF1、FMPF4）是紫蘇醛提取的優(yōu)質(zhì)資源，同時(shí)提示紫蘇醛含量與葉型具有一定的相關(guān)性。

2.4 不同生長時(shí)期紫蘇葉中紫蘇醛含量的變化 對4種紫蘇營養(yǎng)期、開花期和果熟期3個(gè)不同生長時(shí)期的葉中紫蘇醛含量測定如表4所示，同一紫蘇不同生長時(shí)期的葉中紫蘇醛含量均有顯著性差異（P< 0.05），變化規(guī)律為開花期>營養(yǎng)期>

果熟期。因此，僅從紫蘇醛的含量用藥來考慮，選擇開花期前后采摘紫蘇葉為最佳時(shí)期，同時(shí)提示果熟期的老葉也具有較高的藥用價(jià)值。

3 結(jié)論

該研究建立了高效液相色譜快速檢測紫蘇中紫蘇醛的方法，流動相為甲醇∶水=78∶22，流速為1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，紫蘇醛的保留時(shí)間為 6 min左右，與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道的相比，該方法快速、成本低、毒性小。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以甲醇為提取劑，紫蘇醛提取率為響應(yīng)值，對紫蘇醛提取率影響較大的料液比、提取時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，采用兩因素三水平的CCD設(shè)計(jì)，其他條件固定為超聲提取溫度35 ℃、提取1次、頻率40 kHz、功率300 W，最優(yōu)條件為料液比1∶60、提取時(shí)間24 min，試驗(yàn)值達(dá)7.517 mg/g。

對梵凈山4種紫蘇（FMPF1、FMPF2、FMPF3、FMPF4）莖、葉、果萼和籽4個(gè)部位中紫蘇醛檢測結(jié)果顯示，同一紫蘇莖、葉、果萼、 籽中紫蘇醛含量均有顯著差異（P<0.05），主要集中在葉和果萼中；4種紫蘇葉、果萼的紫蘇醛含量差異顯著（P<0.05），F(xiàn)MPF1、FPF4紫蘇葉中紫蘇醛含量分別為7.537和6.139 mg/g，果萼中的含量分別為3.712、3.887 mg/g。與文獻(xiàn)報(bào)道相比[13，15-16]，梵凈山紫蘇（FMPF1、FMPF4）是紫蘇醛提取的優(yōu)質(zhì)資源。僅從紫蘇醛的含量用藥來考慮，紫蘇醛含量與葉型具有一定的相關(guān)性，可憑紫蘇葉的外部形態(tài)來判斷，其變化規(guī)律為FMPF1>FMPF4>FMPF2>FMPF3；用藥部位選擇葉最理想，果萼次之；同時(shí)選擇開花期前后采摘紫蘇葉為最佳時(shí)期。這一結(jié)果為梵凈山紫蘇資源利用與開發(fā)提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]中國科學(xué)院《中國植物志》編委會.中國植物志：第66卷 [M].北京：科學(xué)出版社，1977：282-287.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015版第一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：338-339.

[3] 伍永富，秦少容，劉世琪.紫蘇葉油的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（8）：2019-2020.

[4] OMARISIAW E，WANG Q L，SUN C Y，et al.Tissue distribution and enhanced in vivo antihyperlipidemicantioxidant effects of perillaldehydeloaded liposomal nanoformulation against Poloxamer 407induced hyperlipidemia[J].International journal of pharmaceutics，2016，513（1/2）：68-77.

[5] ZHU J X，HU W Q，DONG S Q，et al.Hippocampal BDNF signaling is required for the antidepressant effects of perillaldehyde[J].Pharmacological reports，2019-01-16[2019-01-11].https：//doi.org/10.1016/j.pharep.2019.01.009.

[6] 周美玲.紫蘇揮發(fā)油及其主要成分紫蘇醛和檸檬烯對小鼠生長和免疫功能的影響[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2014.

[7] XU L X，LI Y B，F(xiàn)U Q，et al.Perillaldehyde attenuates cerebral ischemiareperfusion injurytriggered overexpression of inflammatory cytokines via modulating Akt/JNK pathway in the rat brain cortex[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，454（1）：65-70.

[8] 張嫚.紫蘇醛對甘薯采后黑斑病的防治及其病原真菌的作用機(jī)制[D].徐州：江蘇師范大學(xué)，2018.

[9] 石程仁，張初署，杜詠梅，等.不同植物抑制劑對黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒的影響[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2017，8（8）：2892-2897.

[10] TIAN J，WANG Y Z，ZENG H，et al.Efficacy and possible mechanisms of perillaldehyde in control of Aspergillus niger causing grape decay[J].International journal of food microbiology，2015，202：27-34.

[11] ELEGBEDE J A，F(xiàn)LORES R，WANG R C.Perillyl alcohol and perillaldehyde induced cell cycle arrest and cell death in BroTo and A549 cells cultured in vitro[J].Life sciences，2003，73（22）：2831-2840.

[12] 何順志，徐文芬.貴州中草藥資源研究[M].貴陽：貴州科技出版社，2007：281-282.

[13] 耿榕徽，楊宇杰，胡春蘭，等.紫蘇葉中紫蘇醛的提取與含量測定[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（7）：4-7.

[14] TAO L H，PEREIRA M A.Quantification of carvone，cineole，perillaldehyde，perillyl alcohol and sobrerol by isocratichighperformance liquid chromatography[J].Journal of chromatography A，1998，793（1）：71-76.

[15] 魏長玲，郭寶林，張琛武，等.中國紫蘇資源調(diào)查和紫蘇葉揮發(fā)油化學(xué)型研究[J].中國中藥雜志，2016，41（10）：1823-1834.

[16] 張琛武.紫蘇醛型紫蘇種質(zhì)篩選及紫蘇醛含量變化規(guī)律研究[D].太源：山西醫(yī)科大學(xué)，2017.