應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇子實(shí)體多糖提取工藝

劉曉敏 黎玉婷 沈彩奕

摘要 采用熱水浸提和乙醇沉淀法提取金針菇子實(shí)體多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法來優(yōu)化多糖的工藝條件。結(jié)果表明，多糖提取的最優(yōu)條件為水料比40，浸提時間2.26 h，浸提溫度95 ℃，粗多糖得率為3.82%。

關(guān)鍵詞 金針菇子實(shí)體多糖；Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)；熱水浸提

中圖分類號 TQ914.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）08-0159-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.042

Abstract The polysaccharides were prepared by hot water extraction and ethanol precipitation.The method of response surface analysis was used to optimize the technological conditions of polysaccharide on the basis of single factor test.The results showed that the optimal conditions were as follows：watermaterial ratio 40，extraction time 2.26 h，extraction temperature 95 ℃，crude polysaccharide yield 3.82%.

Key words Polysaccharide form Flammulina velutipes；BoxBehnken design；Hot water extraction

金針菇（Flammulina velutipes）又名樸菇、冬菇、構(gòu)菌、毛柄金錢菌，其子實(shí)體是一種營養(yǎng)豐富、藥理作用廣泛的藥食兩用真菌[1-3]。金針菇富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和粗纖維，不僅含有鋅、錳、鐵、硒、銅等多種微量元素，還富含多種人體必需氨基酸，是一種不可多得的高營養(yǎng)食品[4-5]。由于金針菇含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、倍半萜、火菇素等多種生物活性物質(zhì)，因此被認(rèn)為具有很高的藥用價值[1，6]。

金針菇多糖是金針菇中含量最為豐富的生物活性成分[7]。目前已經(jīng)分離到數(shù)百種具有生理活性的多糖[8]，金針菇多糖具有護(hù)肝[9]、抗氧化、延緩衰老[10]、降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病[11]、抗腫瘤[12] 、消炎、抗病毒、提高記憶力[13]等多種生理活性，已成為食品科學(xué)、天然產(chǎn)物、生物化學(xué)與生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，由于天然提取物的安全優(yōu)勢，開發(fā)和利用天然防腐劑已成為發(fā)展趨勢，黃瓊等[14]測試了金針菇多糖對細(xì)菌、真菌的抑制作用，闡述了金針菇多糖對食品防腐具有一定的作用，有望開發(fā)為廣譜、高效、低毒的新型防腐劑。目前，金針菇工廠化生產(chǎn)發(fā)展十分迅猛，其產(chǎn)量僅次于雙孢蘑菇和香菇，被列為第三大食用菌[7]。在食用鮮菇產(chǎn)量急劇增加的同時，提高金針菇的產(chǎn)后附加值，開展金針菇多糖的研究顯得尤為重要。金針菇多糖提取工藝參數(shù)不同，多糖得率差異很大，為提高多糖得率，進(jìn)行提取工藝參數(shù)的篩選顯得尤為重要。筆者采用對多糖結(jié)構(gòu)影響小的熱水浸提法提取金針菇多糖，進(jìn)行不同提取工藝參數(shù)的篩選，并用響應(yīng)面分析法對工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期篩選出多糖提取的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 試驗(yàn)所用金針菇子實(shí)體購于武漢市江夏區(qū)陽光好又多量販超市，葡萄糖、無水乙醇、正丁醇、氯仿等試劑皆為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器 電子粉碎機(jī)、DHG-914385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、HH-6恒溫水浴鍋、AL104電子天平、TG16-WS高速臺式離心機(jī)。

1.3 金針菇子實(shí)體多糖的浸提 將金針菇子實(shí)體于烘箱中60 ℃過夜烘干至恒重，烘干后放入粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，制得金針菇干粉。稱取金針菇干粉5 g，加適量85%乙醇室溫下浸泡2 h去脂，5 000 r/min離心12 min，小心傾倒去上清液，揮發(fā)干凈乙醇，按水料比20∶1加入蒸餾水，90 ℃條件下浸提2 h。水浴結(jié)束后，5 000 r/min離心15 min取上清，將沉淀反復(fù)用蒸餾水洗滌2次，合并上清提取液，向提取液中加入Sevag試劑，樣品與試劑比為1∶0.2，振蕩萃取，取上層液，重復(fù)3次。萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原體積的1/5～1/4。向濃縮液中加入3倍體積的70%乙醇，沉淀多糖，靜置過夜，5 000 r/min離心15 min，取沉淀于60 ℃烘箱烘干至恒重。

多糖提取率=多糖質(zhì)量（g）/干粉質(zhì)量（g）×100%

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 水料比對金針菇子實(shí)體多糖得率的影響。取金針菇干粉5 g，分別加50、100、150、200、250 mL蒸餾水，其他同“1.3”，以蒸餾水作為空白對照，每個處理3個平行試驗(yàn)，取各提取率的平均值。

1.4.2 浸提時間對金針菇子實(shí)體多糖得率的影響。取金針菇干粉5 g，分別浸提1、2、3、4、5 h，其他同“1.3”，以蒸餾水作為空白對照，每個處理3個平行試驗(yàn)，取各提取率的平均值。

1.4.3 浸提溫度對金針菇子實(shí)體多糖得率的影響。取金針菇干粉5 g，分別在55、65、75、85、95、100 ℃下浸提，其他同“1.3”，以蒸餾水作為空白對照，每個處理3個平行試驗(yàn)，取各提取率的平均值。

1.5 最佳工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取水料比（X1）、浸提時間（X2）、浸提溫度（X3）為考察對象，以金針菇子實(shí)體多糖得率（Y）為響應(yīng)值，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法確定最佳提取工藝條件，試驗(yàn)因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 水料比對金針菇子實(shí)體多糖提取率的影響。在水料比小于30時，金針菇子實(shí)體多糖得率逐漸升高，在水料比為30時，金針菇子實(shí)體多糖得率為3.59%（圖1），之后水料比繼續(xù)增大，但金針菇子實(shí)體粗多糖得率呈下降趨勢。因此，最佳水料比為30。

2.1.3 浸提溫度對金針菇子實(shí)體多糖提取率的影響。浸提溫度低于75 ℃，多糖得率普遍偏低且變化不大，75～95 ℃多糖得率上升趨勢很明顯（圖3），在95 ℃粗多糖得率達(dá)到最大值3.56%，溫度再上升，粗多糖得率開始下降。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化金針菇子實(shí)體多糖提取條件

2.2.1 模型方程的建立和顯著性檢驗(yàn)。金針菇子實(shí)體多糖提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

利用 Design-Expert.V8.0.6軟件對17個試驗(yàn)點(diǎn)的金針菇子實(shí)體多糖產(chǎn)量進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析。方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，模型P值小于 0.000 1，說明得出的回歸方程的關(guān)系是顯著的?；貧w模型的失擬項(xiàng)P=0.278 4>0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，所以在被檢測變量值即浸提時間、浸提溫度、水料比3個因素隨意組合的情況下，用該模型方程預(yù)測金針菇子實(shí)體粗多糖的得率都是合適的。3因素對金針菇子實(shí)體多糖得率影響作用由大到小順序?yàn)榻釡囟取⒔釙r間、水料比，且浸提溫度和水料比對金針菇子實(shí)體多糖得率的線性影響顯著，而浸提時間對金針菇子實(shí)體多糖得率的影響不顯著。

2.2.2 各因素間的相互影響。通過三維響應(yīng)曲面圖和等高線圖可以直觀觀察各個因素（水料比、浸提溫度、浸提時間）對響應(yīng)值（金針菇子實(shí)體粗多糖得率）的影響以及各因素之間的交互作用。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，如果2個因素的交互作用顯著，等高線表現(xiàn)為橢圓形，若2個因素的交互作用不顯著，等高線則反映為圓形。

圖4表明水料比和浸提時間的交互作用不顯著。金針菇子實(shí)體多糖得率隨浸提時間增加其上升趨勢并不顯著，隨水料比增大而有所提高。

圖5結(jié)果顯示，浸提溫度和水料比的交互作用不顯著。金針菇子實(shí)體多糖得率在水料比增大的情況下有小幅度增加的趨勢，在浸提溫度低于90 ℃時金針菇子實(shí)體多糖得率逐漸提高，當(dāng)溫度超出這個范圍后金針菇子實(shí)體多糖得率開始緩慢下降。

圖6表明浸提時間與浸提溫度的交互作用不顯著。金針菇子實(shí)體多糖得率在浸提時間升高的同時稍許上升但并不顯著，在浸提溫度低于90 ℃時金針菇子實(shí)體多糖得率逐漸提高，當(dāng)溫度超出這個范圍后金針菇子實(shí)體多糖得率開始緩慢下降。

2.2.3 響應(yīng)面方程優(yōu)化配置。運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6軟件通過多元回歸擬合，獲得金針菇子實(shí)體多糖得率與自變量水料比、浸提時間、浸提溫度之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=3.74+0.12X1+0.14X2+0.47X3+0.057X1X2-0.002 5X1X3+0.02X2X3-0.19X12-0.41X22-0.45X32

通過Design-Expert.V8.0.6軟件求偏微分方程得到最佳條件為水料比40，浸提時間2.26 h，浸提溫度95.21 ℃（為方便實(shí)際操作取95 ℃），粗多糖得率為3.82%。為檢驗(yàn)該優(yōu)化工藝的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到金針菇多糖產(chǎn)量的驗(yàn)證值為4.02%，與理論值相近，說明該優(yōu)化條件可信。因此，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化金針菇子實(shí)體多糖提取工藝是有效可行的。

3 結(jié)論

通過單因素和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)得到金針菇子實(shí)體多糖的最佳提取工藝條件為水料比40，浸提時間2.26 h，浸提溫度95 ℃，在此工藝條件下，粗多糖得率為3.82%。通過與其他提取方法比較，該工藝具有較高的提取率，馮昆等[15]在最優(yōu)條件下提取金針菇子實(shí)體多糖得率為1.54%。采用熱水浸提和乙醇沉淀法提取金針菇子實(shí)體多糖工藝簡單、費(fèi)時少且成本低，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到金針菇子實(shí)體多糖提取條件多糖得率高，具有推廣應(yīng)用的價值，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供必要的技術(shù)支持，后期將進(jìn)一步對金針菇多糖組成結(jié)構(gòu)和抑菌活性展開研究。

參考文獻(xiàn)

[1]韓樂，韓偉，張美彥，等.金針菇子實(shí)體有機(jī)溶劑提取物的生物活性[J].菌物學(xué)報，2016，35（2）：178-187.

[2] 許昭儀，李浩，張平.金針菇生活史各階段核相研究[J].菌物學(xué)報，2015，34（3）：386-393.

[3] 高瓊，鄧志峰，遲全勃，等.食用菌居家栽培產(chǎn)品的研究[J].北方園藝，2015（5）：148-150.

[4] 安琪，吳雪君，吳冰，等.不同碳源和氮源對金針菇降解木質(zhì)纖維素酶活性的影響[J].菌物學(xué)報，2015，34（4）：761-771.

[5] 米青榮，劉貴巧，王秋敏，等.邯鄲市金針菇品種資源調(diào)查及優(yōu)良品種篩選試驗(yàn)[J].北方園藝，2015（20）：130-133.

[6] 周素娟，張曉娜.食用菌保健功能及保健食品應(yīng)用與開發(fā)[J].中國食用菌，2015，34（1）：4-6.

[7] 李文香，樊銘聰，張圣杰，等.金針菇多糖組成的探討與分析[J].中國食用菌，2015，34（2）：60-65.

[8] 張占軍，張艷艷.多糖分子修飾研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)，2017，38（5）：253-257.

[9] PANG X B，YAO W B，YANG X B，et al.Purification，characterization and biological activity on hepatocytes of a polysaccharide from Flammulina velutipes mycelium[J].Carbohydrate polymers，2007，70：291-297.

[10] 葉敏.金針菇多糖的提取及清除羥自由基活性研究[J].畢節(jié)學(xué)院學(xué)報，2011，29（4）：90-94.

[11] 王玉峰，王旻，尹鴻萍.金針菇菌絲體中多糖的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及免疫學(xué)活性[J].中國天然藥物，2008，6（4）：312-315.

[12] LEUNG M Y K，F(xiàn)UNG K P，CHOY Y M.The isolation and characterization of an immunomodulatory and anti-tumor polysaccharide preparation from Flammulina velutipes[J].Immunopharmacology，1997，70：255-263.

[13] 王衛(wèi)國，張仟偉，李瑞靜，等.金針菇多糖的生理功能及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，37（1）：120-128.

[14] 黃瓊，馬仲文，賴騰強(qiáng).金針菇多糖抑菌作用的研究[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（1）：10-12.

[15] 馮昆，張東杰，張澗錚，等.金針菇多糖提取條件的優(yōu)化[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2005，17（5）：73-76.