樹鼩腸道菌群多樣性與功能預(yù)測(cè)研究

楊學(xué)芳 李波 鄭紅

摘要[目的]鑒定樹鼩的腸道菌群，分析樹鼩腸道菌群多樣性和豐度，并進(jìn)行菌群功能預(yù)測(cè)。[方法]隨機(jī)采集3份雄性樹鼩糞便樣品，提取樹鼩糞便中細(xì)菌基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得16S rRNA V3～V4片段，采用高通量Illumina PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，利用BIPES以及QIIME分析并比較菌群結(jié)構(gòu)及多樣性。最后，通過(guò)PICRUS t軟件對(duì)腸道菌群的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。[結(jié)果]樹鼩腸道糞便細(xì)菌有9門20綱33目53屬122種208個(gè)OTU。門水平上，優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；

屬水平上，埃希氏桿菌屬（Escherichia）、乳酸菌屬（Lactobacillus）和腸球菌屬（Enterocossus）為優(yōu)勢(shì)菌群。PICRUS t功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，腸道細(xì)菌編碼的大多數(shù)基因與代謝相關(guān)，其次是基因信息加工、環(huán)境信息加工。COG功能分類分析表明腸道微生物基因在“氨基酸的運(yùn)輸和代謝”和“碳水化合物運(yùn)輸與代謝”功能類群的相對(duì)豐度較高。[結(jié)論]PICRUS t功能預(yù)測(cè)到樹鼩腸道菌群主要與代謝相關(guān)，樹鼩腸道菌群是研究腸道菌群與代謝類疾病的一種良好試驗(yàn)材料。

關(guān)鍵詞樹鼩；腸道菌群；16S rRNA；菌株功能

中圖分類號(hào)S852.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）08-0101-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.026

Abstract[Objective]To identify the intestinal flora of Tupaia belangeri，analyze the diversity and abundance，and predict the function of the flora.[Method]Three male feces samples of T.belangeri were randomly collected，bacterial genomic DNA were extracted from the feces samples of T.belangeri to make PCR amplification.16S rRNA V3V4 fragments were obtained.The highthroughput Illumina PE300 platform was used for sequencing，and the structure and diversity of the bacterial flora were analyzed by BIPES and QIIME.The function of intestinal flora was predicted through PICRUS t.[Result]There were 9 phyla，20 phyla，33 orders，53 genera，122 species，208 OTU in the intestinal fecal flora of T.belangeri.Firmicutes and Proteobacteria dominated at the level of phylum.

At the level of genus，Escherichia，Lactobacillus and Enterocossus were the dominant flora.The functional prediction results by PICRUS t showed that most genes encoded by gut bacteria were associated with metabolic "metabolism"，followed by genetic information processing "based information processing"，environmental information processing "environmental information processing".COG gene function classification statistics showed that the relative abundance of intestinal flora in "amino acid transport and metabolism" and "carbohydrate transport and metabolism" were higher.[Conclusion]The function of PICRUS t predicted that the intestinal flora of T.belangeri was mainly related with the metabolism，and the intestinal flora of T.belangeri was a good experimental material for studying intestinal flora and metabolic diseases.

Key wordsTupaia belangeri；Intestinal flora；16S rRNA；Function of strain

樹鼩隸屬攀緣目（Scandentia）樹鼩科（Tupaiidae），是靈長(zhǎng)類動(dòng)物的近親[1]。研究表明，樹鼩在進(jìn)化關(guān)系、解剖結(jié)構(gòu)、新陳代謝等方面比大鼠、小鼠更接近于人類[2]，常用于替代或減少一些非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的使用，在腫瘤學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生殖生物學(xué)、免疫學(xué)等方面對(duì)樹鼩已有廣泛和深入的研究[3]。

腸道是人體最大的消化和排泄器官，存在數(shù)以億計(jì)的微生物與宿主共生，腸道菌群是宿主不可或缺的一部分。正常腸道菌群在宿主營(yíng)養(yǎng)代謝、藥物代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面起著重要作用[4]。腸道菌群與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用是彼此多方向的、交互式的化學(xué)交流傳遞通道[5]。腸道菌群產(chǎn)生的膽汁酸、膽堿、短鏈脂肪酸是宿主健康所必需的物質(zhì)[6]。機(jī)體的正常活動(dòng)以及消化食物、機(jī)體免疫功能及抗病能力、排便功能等都離不開菌群的參與，并需要它們發(fā)揮應(yīng)有的作用，正常菌群的失調(diào)可能導(dǎo)致諸多疾病[7]。

以前采用傳統(tǒng)的分離與培養(yǎng)、構(gòu)建克隆文庫(kù)、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）、熒光原位雜交（FISH）等方法揭示腸道微生物的多樣性[8]，但這些方法有很大的局限性。高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代的測(cè)序方法，具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度，極大地提高了對(duì)樣品中微生物多樣性分析的深度和廣度，加深人們對(duì)腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)和功能的了解?；诩?xì)菌16S rRNA 的高通量基因測(cè)序分析已成為研究腸道菌群與疾病間關(guān)系的重要工具。筆者通過(guò)高通量測(cè)序細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)測(cè)序，鑒定樹鼩的腸道菌群，對(duì)樹鼩腸道菌群多樣性、豐度和菌群功能代謝進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

3只健康成年雄性樹鼩，體重140～160 g，來(lái)源于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部[SCXK（滇） K2013-0002]，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室，單籠飼養(yǎng)，飲用城市供應(yīng)的自來(lái)水，每日定時(shí)飼喂全價(jià)顆粒飼料，動(dòng)物飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，濕度 40%～60%，明暗交替照明12 h。

1.2方法

1.2.1樹鼩糞便的收集。抓取并保定樹鼩，多數(shù)樹鼩在抓取過(guò)程中因緊張而主動(dòng)排出糞便，對(duì)無(wú)糞便者輕輕按摩其腹部，使其排便，每只樹鼩采集豌豆粒大小的新鮮糞便標(biāo)本。

1.2.2糞便樣品的混懸與稀釋。將糞便樣品混懸到無(wú)菌生理鹽水中后，以10倍遞增梯度進(jìn)行稀釋。

1.2.3DNA的提取與檢測(cè)。

使用糞便基因組提取試劑盒E.Z.N.A. soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.），從樹鼩糞便樣品中提取細(xì)菌DNA，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性檢測(cè)。

1.2.4PCR擴(kuò)增。按照指定測(cè)序區(qū)域，擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域?yàn)?6S rRNA基因的V3和V4區(qū)域，引物名稱為338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′） ，合成帶有barcode的特異引物。

1.2.5熒光定量。

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用Quanti FluorTM -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，此后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.2.6Miseq文庫(kù)構(gòu)建和Miseq測(cè)序。文庫(kù)的制備和上機(jī)測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3生物信息學(xué)分析Miseq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU（operational taxonomic unit）聚類，在聚類過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。基于Silva數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用RDP classifier 2.2對(duì)每個(gè)OTU的最長(zhǎng)16S rRNA序列片段進(jìn)行相似性比對(duì)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本中細(xì)菌在門、綱、目、科、屬、種各分類水平上的構(gòu)成[9]。在上述分析的基礎(chǔ)上，對(duì)樹鼩腸道菌群代謝功能預(yù)測(cè)等進(jìn)行分析。

PICRUS t對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，去除16S marker gene在物種基因組中的拷貝數(shù)目的影響；然后，通過(guò)每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的green gene id，比對(duì)到COG和KEGG庫(kù)，獲得OTU對(duì)應(yīng)的COG家族信息和KO信息；計(jì)算各COG的豐度和KO豐度。根據(jù)比對(duì)到COG庫(kù)的COG編號(hào)，可以從基因的進(jìn)化譜系（egg NOG）數(shù)據(jù)庫(kù)中解析到各個(gè)COG的描述信息及其功能信息，從而得到功能豐度譜；根據(jù)比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，獲得KO、Pathway、EC信息，并根據(jù)OTU豐度計(jì)算各功能類別的豐度。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)序結(jié)果物種注釋與評(píng)估

從3只成年雄性樹鼩的糞便樣品中共得到高質(zhì)量質(zhì)控序列58 328條，序列長(zhǎng)度主要分布在441～460 bp，其他少量分布在421～440 bp。

2.1.1樹鼩腸道菌群α-多樣性指數(shù)分析。從圖1可以看出，3個(gè)樹鼩樣品的α-多樣性相差不大。

2.1.2OTUs稀釋曲線。從圖2可以看出，隨著測(cè)序深度的逐漸增加，OTUs稀釋曲線趨于平坦，說(shuō)明更多的測(cè)序數(shù)量對(duì)于OTU的邊際貢獻(xiàn)較小，測(cè)序的數(shù)據(jù)量較為合理。3個(gè)樣品的稀釋曲線趨于平緩（圖2），說(shuō)明樣品測(cè)序量是足夠的，足以覆蓋所有微生物的組成。

2.2樹鼩腸道菌群的物種組成分析

在97%的相似水平上進(jìn)行OTU序列分類，共聚成208個(gè)可操作分類單元（OUT）。腸道細(xì)菌隸屬9門20綱33目53屬122種。這9個(gè)門分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬 桿 菌 門 （Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、 柔膜菌門（Tenericutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）。從圖3可以看出，門水平上優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門（Proteobacteria，占61.22%）和厚壁菌門（Firmicutes，占36.65%）。從圖4可以看出，屬水平上埃希氏桿菌屬（Escherichia）占59.72%，乳酸菌屬（Lactobacillus）占26.86%，腸球菌屬（Enterocossus）占6.36%，這3個(gè)屬為優(yōu)勢(shì)菌群。

2.3PICRUS t軟件預(yù)測(cè)

腸道細(xì)菌菌群功能基因和代謝途徑分布表明，KEGG代謝通路中樹鼩腸道細(xì)菌編碼的大多數(shù)基因與代謝相關(guān)（表1）。COG功能分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，微生物基因在“氨基酸的運(yùn)輸和代謝”和“碳水化合物運(yùn)輸與代謝”功能類群的相對(duì)豐度較高（圖5）。

3討論

筆者通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序分析樹鼩腸道菌群，共得到9門20綱33目53屬122種208個(gè)OUT。該試驗(yàn)覆蓋率為0.99，說(shuō)明樹鼩大腸細(xì)菌99.9%多樣性情況得到體現(xiàn)。每個(gè)樣本的稀釋曲線都趨于平緩，表明該試驗(yàn)的測(cè)序量能夠覆蓋各樣本的大多數(shù)微生物。樹鼩腸道細(xì)菌門水平上豐度較高的是變形菌門和厚壁菌門。其他菌群為放線菌門、擬桿菌門、疣微菌門、柔壁菌門、梭桿菌門（Fusobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門、螺旋體菌門。在門水平上，樹鼩腸道菌群比嚙齒類動(dòng)物（大鼠、小鼠）更接近于人類。研究表明，小鼠腸道菌群在門水平上主要為放線菌門、擬桿菌門、脫鐵桿菌門（Deferribactcres）、廣古菌門（Euryarchaeota）、壁厚菌門、變形菌門、柔壁菌門、疣微菌門9個(gè)門[10]。大鼠糞便菌群主要為厚壁菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻菌門、軟壁菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門[11]。人體腸道中的菌群主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，這3門細(xì)菌占總細(xì)菌量的80%以上，其他細(xì)菌主要有藍(lán)藻菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門、 疣微菌門、螺旋體菌門。在健康人類和樹鼩腸道菌群被鑒定到的螺旋體菌門，在大小鼠腸道菌群中未被發(fā)現(xiàn)。

使用PICRUS t軟件計(jì)算方法[12-13]預(yù)測(cè)微生物16S rRNA文庫(kù)，對(duì)其功能基因和類群進(jìn)行了探索，進(jìn)而將菌群結(jié)構(gòu)與宿主代謝相聯(lián)系。研究表明，PICRUS t軟件對(duì)腸道菌群功能基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度為85%～90%[14]。該軟件在 KEGG通路水平輸出預(yù)測(cè)的代謝功能豐度，得到的通路譜用于下游比較分析。通過(guò)與KEGG的比對(duì)搜索，筆者發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌編碼的大多數(shù)基因與代謝相關(guān)，其次是基因信息加工、環(huán)境信息加工。

COG功能分類統(tǒng)計(jì)表明，腸道微生物基因在“氨基酸的運(yùn)輸和代謝”和“碳水化合物運(yùn)輸與代謝”功能類群的相對(duì)豐度較高，說(shuō)明這些腸道細(xì)菌的主要功能是維持正常狀態(tài)下細(xì)胞的基本生理活動(dòng)。功能基因主要與代謝相關(guān)，推測(cè)樹鼩腸道菌群可能是研究代謝類相關(guān)疾病的良好動(dòng)物模型。

腸道菌群與宿主的營(yíng)養(yǎng)、疾病的發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)[15]。宿主為腸道菌群的生長(zhǎng)繁殖提供必要條件，菌群在腸道內(nèi)代謝活動(dòng)產(chǎn)生物質(zhì)作用于宿主，影響宿主整個(gè)生命過(guò)程。腸道微生物在宿主體內(nèi)具有抵御病原菌侵襲、促進(jìn)免疫器官成熟、激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用等功能，例如微生物可以與腸道黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)，發(fā)動(dòng)非特異性防御功能[16]。厚壁菌門在腸道中能夠幫助多糖發(fā)酵，厚壁菌門和擬桿菌門可協(xié)助宿主從本身無(wú)法消化的食物成分中提取更多的能量，維持動(dòng)物腸道的健康[17]。因而，研究腸道菌群多樣性及菌株對(duì)宿主的功能對(duì)于探討人類疾病的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]XIAO J，LIU R，CHEN C S.Tree shrew （Tupaia belangeri） as a novel laboratory disease animal model [J].Zool Res，2017，38（3）：127-137.

[2] LI R F，YUAN B，XIA X S，et al.Tree shrew as a new animal model to study the pathogenesis of avian influenza （H9N2） virus infection [J].Emerging microbes & infections，2018，7（166）：1-11.

[3] 黃曉燕，徐娟，孫曉梅，等.樹鼩在人類疾病動(dòng)物模型中應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2013，30（2）：59-64.

[4] 劉昌孝.腸道菌群與健康、 疾病和藥物作用的影響[J].中國(guó)抗生素雜志， 2018，43（1）：1-12.

[5] BEYOGˇLU D，SMITH R L，IDLE J R.Dog bites man or man bites dog？ The enigma of the amino acid conjugations [J].Biochem pharmacol，2012，83（10）：1331-1339.

[6] UMESAKI Y， SETOYAMA H.Structure of the intestinal flora responsible for development of the gut immune system in a rodent model [J].Microbes Infect，2000，2（11）：1343-1351.

[7] 沈男，劉毅，蓋中濤.腸道菌群與腸道疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2018，38（7）：1034-1037.

[8] CAPORASOA J G，LAUBERB C L，WALTERS W A，et al.Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample [J].PANS，2011，108（S1）： 4516-4522.

[9] QUSAT C，PRUESSE E，YILMAZ P，et al.The SILVA ribosomal RNA gene dataset project：Improved data processing and webbased tools[J].Nucl Acids Res，2013，41： 590-596.

[10] 楊俊花，趙志輝，郭文博，等.應(yīng)用Illumina-MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)小鼠腸道菌群的影響 [J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2017，29（1）：158-167.

[11] 張芹，周中凱，任曉沖，等.高通量測(cè)序技術(shù)研究糖尿病大鼠與正常大鼠糞便菌群的結(jié)構(gòu)差異[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2017，17（6）： 232-238.

[12] MORGAN X C，TICKLE T L，SOKOL H，et al.Dysfunction of the intestinal microbiome in inflammatory bowel disease and treatment [J].Genome Biol，2012，13（9）：1-18.

[13] LANGILLE M G，ZANEVELD J，CAPORASO J G，et al.Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences [J].Nature biotechnology，2013，31（9）： 814-821.

[14] LEY R E，TURNBAUGH P J，KLEIN S，et al.Microbial ecology：Human gut microbes associated with obesity [J].Nature，2006，444： 1022-1023.

[15] LEY R E，PETERSON D A，GORDON J I.Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine [J].Cell，2006，124（4）：837-848.

[16] HOOPER L V，MACPHERSON A J.Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota[J].Nat Rev Immunol，2010，10（3）：159-169.

[17] RUIZ L，MARGOLLES A，SNCHEZ B.Bile resistance mechanisms in Lactobacillus and Bifidobacterium[J].Frontiers in microbiology，2013，4： 396.