冷藏鱸魚(yú)片優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定及致腐能力分析

趙宏強(qiáng) 藍(lán)蔚青* 孫曉紅 劉書(shū)成 謝 晶

（1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái) 食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)）上海201306 2 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東湛江524088）

鱸魚(yú)（Lateolabrax japonicus）又名鱸板、花鱸、四肋魚(yú)等，屬鱸形目鱸科鱸屬經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，主要分布于太平洋西部與中國(guó)沿海，其中又以我國(guó)黃海、渤海較多。鱸魚(yú)肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，其體內(nèi)富含蛋白質(zhì)、VA、VB、鈣、鎂、鋅、硒等營(yíng)養(yǎng)元素，具補(bǔ)肝腎、益脾胃、化痰止咳功效，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。然而，由于魚(yú)肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與水分含量較高，魚(yú)體組織易受內(nèi)源酶與微生物的作用，會(huì)代謝產(chǎn)組胺、硫吲哚、醛等腐敗物質(zhì)，使魚(yú)肉產(chǎn)生不可接受的氣味，影響其食用與銷(xiāo)售。

水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌為水產(chǎn)品貯藏期間，對(duì)其腐敗過(guò)程起著主導(dǎo)作用的特定菌，其致腐能力要明顯強(qiáng)于其它細(xì)菌，對(duì)水產(chǎn)品貨架期有著密切關(guān)系[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者開(kāi)始定量研究腐敗菌致腐能力。如Dalaaard 等[3]利用腐敗菌產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物作為其腐敗能力的定量指標(biāo)。許振偉等[4-5]進(jìn)行腐敗菌致腐能力定量研究時(shí)，將腐敗菌接種至無(wú)菌魚(yú)塊，由貯藏過(guò)程中的感官與腐敗產(chǎn)物變化，以腐敗代謝產(chǎn)物——揮發(fā)性鹽基氮（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）與微生物生長(zhǎng)量間的比例關(guān)系，表征優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐能力?；诖?，本文通過(guò)前期冷藏鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離篩選，結(jié)合菌落形態(tài)觀(guān)察、生理生化實(shí)驗(yàn)與16S rDNA 分子鑒定技術(shù)等方法對(duì)其分離菌株進(jìn)行鑒定，以TVB-N 值與菌落總數(shù)作為定量指標(biāo)，致腐因子YTVB-N/CFU 為定量標(biāo)準(zhǔn)，綜合評(píng)價(jià)優(yōu)勢(shì)腐敗菌菌株致腐能力，為后期研究鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的作用機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料

鮮活鱸魚(yú)購(gòu)于上海農(nóng)工商港城超市，將原料保持鮮活狀態(tài)在30 min 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要藥品試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、假單胞菌CFC 選擇性培養(yǎng)基、VRBDA-腸道菌瓊脂培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、鐵瓊脂培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、PCR 擴(kuò)增試劑與合成擴(kuò)增引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司等。

1.3 主要儀器與設(shè)備

DHP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；PowerPac Basic 電泳儀、Universal Hood II 凝膠成像儀，BIO-RAD 公司；Mastercycler6325 PCR 擴(kuò) 增 儀、5427R 離 心 機(jī)，EPPENDORF 公司；AUW320 型分析天平，日本島津公司；TGL-16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；FJ200-S 數(shù)顯高速均質(zhì)機(jī)，杭州齊威儀器有限公司；SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Kjeltec2300 型凱氏定氮儀，丹麥FOSS 公司；LDZM-40KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌分離純化 在無(wú)菌工作臺(tái)中隨機(jī)選取10 g 腐敗末期的鱸魚(yú)樣品，將其置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入90 mL 無(wú)菌生理鹽水封口后拍打2 min。取上清液1 mL，10 倍梯度稀釋?zhuān)x擇3 個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度做3 次重復(fù)，傾注于含有不同選擇培養(yǎng)基的平板中。培養(yǎng)基選擇及培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。

表1 不同微生物的選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Selective culture media and conditions of different bacteria

從上述培養(yǎng)基的平板中挑取各種典型生長(zhǎng)的菌落，在TSA 培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行平板劃線(xiàn)分離，至少3 次劃線(xiàn)分離后得到純化單菌落[6]。最后，于TSB 肉湯中培養(yǎng)，30 ℃搖床培養(yǎng)18 h，使其菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL 后低溫保存。

1.4.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌篩選 將分離純化多次的菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，用無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，搖勻，利用血球計(jì)數(shù)板直接測(cè)定菌液濃度，調(diào)整菌液濃度為105～106CFU/mL[7]。用無(wú)菌手術(shù)刀將鱸魚(yú)背部肉分割成約40 g 大小均勻的肉塊，先用75%酒精噴其表面，靜置10 s 后用無(wú)菌超純水清洗，然后使用酒精燈對(duì)鱸魚(yú)表面進(jìn)行滅菌，再將鱸魚(yú)魚(yú)塊浸泡于調(diào)整過(guò)的菌液30 s 后取出放入無(wú)菌自封袋中，每種菌株接種2 個(gè)肉塊，以2 個(gè)未接種菌液的肉塊為對(duì)照，置于4 ℃冰箱下貯藏。

同時(shí)，參照Parlapani 等[8]法，由10 名訓(xùn)練有素的感官評(píng)價(jià)人員組成評(píng)定小組，分別從樣品外觀(guān)、氣味與彈性3 個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，將腐敗最快肉塊所接種的菌株作為篩選出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[9-10]，選取其中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行菌種鑒定與致腐能力測(cè)定。

1.4.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌鑒定

1.4.3.1 菌落特征與菌體形態(tài)觀(guān)察 在TSA 培養(yǎng)基上多次純化的細(xì)菌，選取長(zhǎng)勢(shì)比較好的單菌落，通過(guò)革蘭氏染色等方法對(duì)其菌落特征與菌體形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察。

1.4.3.2 傳統(tǒng)生理生化試驗(yàn) 根據(jù) 《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]對(duì)菌株進(jìn)行氧化酶、產(chǎn)硫化氫、葡萄糖發(fā)酵、過(guò)氧化氫酶、明膠與山梨醇生理生化鑒定。

1.4.3.3 16S rDNA 鑒定 挑取重新培養(yǎng)18 h 的單菌落至液體培養(yǎng)基中過(guò)夜，采用天根細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒直接提取DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 鱸魚(yú)感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluation standards of Lateolabrax japonicus

以提取的菌液總DNA 作為模板，采用通用引物27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R （5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）來(lái)擴(kuò)增目的基因片段。采用25 μL 體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，即Taq PCR Master Mix （2×）12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、上、下游引物各1 μL 及模板DNA 1 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1×TAE 緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠[13]，取5μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再用溴化乙錠（EB）對(duì)其染色后，在凝膠成像儀中觀(guān)察電泳結(jié)果并拍攝電泳圖譜。每種菌株均獲得長(zhǎng)度1.5 kb 左右的條帶，將PCR 成功的樣品委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

登錄網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），將測(cè)序所得16S rDNA 序列與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行同源比對(duì)，從中選取若干個(gè)相似性高的菌株序列，使用MEGA5.1 軟件，通過(guò)最大似然法（Maximum-Likelihood）做1 000 次隨機(jī)抽樣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力測(cè)定 將篩選所得的優(yōu)勢(shì)腐敗菌按照1.4.2 節(jié)方法制得一定濃度的菌懸液，接種于滅菌的肉塊后放入無(wú)菌自封袋中4℃貯藏。將篩選得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌菌株接種到無(wú)菌的鱸魚(yú)魚(yú)塊上，以未接腐敗菌肉塊作對(duì)照，貯藏在4 ℃冰箱中，定期進(jìn)行TVB-N 和菌落總數(shù)的測(cè)定。將TVB-N 產(chǎn)量因子YTVB-N 作為各優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力的定量指標(biāo)[14]。

1.4.4.1 TVB-N 值 參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——GB 5009.228-2016 《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[15]進(jìn)行鱸魚(yú)肉TVB-N 值測(cè)定。

1.4.4.2 菌落總數(shù) 參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)法》[16]進(jìn)行鱸魚(yú)肉菌落總數(shù)測(cè)定。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析 使用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。數(shù)據(jù)采用3 次平行試驗(yàn)的平均值，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用OriginPro 9.0 繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離篩選

2.1.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌分離 對(duì)菌液采用選擇性培養(yǎng)基，分別在不同的培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)，然后根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況，共選取12 株長(zhǎng)勢(shì)較好、形態(tài)典型的菌落，其中營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1 株（T1），VRBDA-腸道菌瓊脂培養(yǎng)基2 株（E1、E2），鐵瓊脂培養(yǎng)基4 株（S1、S2、S3、S4），假單胞菌CFC 選擇性培養(yǎng)基3株（P1、P2、P3），MRS 瓊脂培養(yǎng)基2 株（L1、L2）。

2.1.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌篩選 將選取的12 株典型菌株進(jìn)行24 h 搖床活化，制成適量菌液，分別接種在無(wú)菌鱸魚(yú)樣品上，以未接種菌液的滅菌樣品作為對(duì)照組，分別進(jìn)行感官分析。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，貯藏初期，鱸魚(yú)樣品表面色澤鮮亮，具有固有清香，肌肉彈性堅(jiān)實(shí)，指壓后凹陷立即消失，樣品新鮮度較好，接種細(xì)菌與未接種細(xì)菌的鱸魚(yú)樣品無(wú)差別，樣品初期品質(zhì)相對(duì)一致。隨著貨架期的延長(zhǎng)，鱸魚(yú)魚(yú)塊品質(zhì)下降，樣品表面色澤亮度降低，逐漸產(chǎn)生不愉快的氣味，其中接種過(guò)菌液的魚(yú)塊感官分值明顯下降。S1、S2、P1、P2 與P3樣品的感官分值顯著下降，第7 天時(shí)，S2 組樣品的感官分值已腐敗嚴(yán)重，樣品表面黏液豐富，色澤暗黃，腐臭味明顯，感官呈不可接受。不同的微生物由于其生物學(xué)特性不同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用也有所差異，其選擇性消耗魚(yú)肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成魚(yú)肉肉質(zhì)腐敗速度的差異[17]。綜合感官評(píng)價(jià)結(jié)果，篩選出使鱸魚(yú)魚(yú)塊腐敗速度較快的5 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌，分別為S1、S2、P1、P2 與P3，后期分別進(jìn)行菌種鑒定和致腐能力測(cè)定。

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌鑒定

2.2.1 細(xì)菌形態(tài)觀(guān)察 通過(guò)對(duì)上述優(yōu)勢(shì)腐敗菌的形態(tài)觀(guān)察，并作革蘭氏染色后鏡檢，觀(guān)察結(jié)果如表3所示。

圖1 不同優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)冷藏鱸魚(yú)感官分值的影響Fig.1 Effect of different spoilage organisms on sensory scores of Lateolabrax japonicus during chilled storage

表3 主要腐敗菌的菌落特征與菌體形態(tài)Table 3 Characteristics of bacterial colony and shape of strains in spoilage organisms

2.2.2 細(xì)菌生理生化特征 對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、山梨醇試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵、3%過(guò)氧化氫酶等6 種傳統(tǒng)生理生化試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 主要腐敗菌的生理生化鑒定表Table 4 Physiological-biochemical characteristics of mainspoilage bacteria

根據(jù)食品微生物鑒定圖譜，并結(jié)合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，通過(guò)鏡檢結(jié)果與生理生化試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)，初步鑒定S1、S2為希瓦式菌屬，P1、P2、P3 為假單胞菌屬。冷藏鱸魚(yú)貯藏末期的優(yōu)勢(shì)腐敗菌分別為希瓦式菌屬與假單胞菌屬。

2.2.3 分子鑒定 對(duì)篩選的5 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行分子鑒定，以5 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并作凝膠電泳檢測(cè)。

從圖2可見(jiàn)，樣品在1.5kb 附近可見(jiàn)清晰明亮條帶，表明其PCR 擴(kuò)增成功，可用于后期測(cè)序。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工公司進(jìn)行分子檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果通過(guò)NCBI 軟件選取同源性最高的菌株序列，用MEGA5.1 進(jìn)行多重序列對(duì)比，并以Maximum-Likelihood 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

由圖3發(fā)育樹(shù)并結(jié)合NCBI 網(wǎng)站最高相似度菌種可知，P1 與假單胞菌屬親緣關(guān)系最近，P2、P3與草莓假單胞菌親緣關(guān)系最近，S1 與腐敗希瓦氏菌親緣關(guān)系最近，S2 與波羅的海希瓦式菌親緣性最近。綜合菌落形態(tài)特征、生理生化鑒定與分子鑒定，可知5 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌中有1 株假單胞菌屬，2株草莓假單胞菌，2 株希瓦式菌屬。在前人研究中，楊憲時(shí)等[18]對(duì)羅非魚(yú)冷藏過(guò)程菌群變化研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌是羅非魚(yú)在0～10 ℃冷藏條件下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。郭全有等[19]對(duì)0 ℃和5 ℃貯藏條件下大黃魚(yú)貨架終點(diǎn)時(shí)菌相研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌與希瓦式菌是冷藏養(yǎng)殖大黃魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。希瓦式菌屬為革蘭氏陰性菌，運(yùn)動(dòng)桿菌，嗜冷性，是水產(chǎn)品中常見(jiàn)的典型腐敗菌，其腐敗能力較強(qiáng)，具有一定的還原能力，可將氧化三甲胺還原成三甲胺，伴隨著硫化氫的產(chǎn)生[20]。在有氧冷藏中，魚(yú)、貝類(lèi)和甲殼類(lèi)的特定腐敗菌 （Specific Spoilage Organisms，SSO）多為假單胞菌或腐敗希瓦氏菌，其中腐敗希瓦氏菌多為海洋溫帶水域的SSO，假單胞菌多為熱帶淡水魚(yú)的SSO。王慧敏等[21]研究了鱸魚(yú)在冷藏條件下，不同貯藏時(shí)間的腐敗菌菌群變化，發(fā)現(xiàn)希瓦氏菌屬（Shewanella spp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas spp.） 細(xì)菌在整個(gè)貯藏時(shí)間內(nèi)均存在，且隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

圖2 5 種菌株的16S rDNA 電泳圖譜（Marker：200bp）Fig.2 16S rDNA electrophoresis map of 5 strains（Marker：200bp）

圖3 基于16S rRNA 序列同源性的5 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 5 strains base on 16S rRNA gene analysis

2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐能力分析

2.3.1 TVB-N 值 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是指肉類(lèi)及水產(chǎn)品在貯藏期間肉中的蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)細(xì)菌與酶的作用下，分解產(chǎn)生氨類(lèi)和胺等揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)，是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)，可反映分解產(chǎn)物的數(shù)量，評(píng)價(jià)水產(chǎn)品的新鮮度[22]。由國(guó)標(biāo)可知，鱸魚(yú)肉的TVB-N 值＜13 mgN/100 g 為一級(jí)鮮度，TVB-N 值＞30 mgN/100 g 為已腐敗[23]。

由圖4可知，樣品在貯藏初期的TVB-N 值為（8.16±0.26）mgN/100 g，無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在一級(jí)鮮度水平，表明接種初期，樣品中的腐敗菌未見(jiàn)增多?？赡苡捎趧偨臃N至樣品表面，細(xì)菌還未適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，并未快速生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。然而，隨著貨架期的延長(zhǎng)，接種腐敗菌的魚(yú)塊在第3 天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)顯著性差異，表明此時(shí)樣品腐敗加劇，代謝產(chǎn)物增多。貯藏第7 天時(shí)，P3 組樣品的TVB-N 值達(dá)（49.88±0.84）mg N/100 g，處于極度腐敗，產(chǎn)生不可接受的刺激性氣味，這與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致，表明P3 在貯藏期間，微生物生長(zhǎng)繁殖較快，消耗鱸魚(yú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物增多。S1，S2 組樣品的TVB-N 值分別是 （42.72±1.09）mg N/100g 與（43.05±0.53）mg N/100 g，兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），可能由于兩種細(xì)菌同為同一種屬，其致腐能力相似。

2.3.2 菌落總數(shù) 菌落總數(shù)變化可反映蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝情況，測(cè)定菌落總數(shù)是衡量鱸魚(yú)腐敗程度的重要參數(shù)。Al-Daqal 等[24]提出水產(chǎn)品可食用的菌落總數(shù)上限是6.0 lg（CFU/g）。當(dāng)TVC值超過(guò)上限值，表明魚(yú)肉腐敗。

由圖5可知，貯藏初期，對(duì)照組樣品的菌落總數(shù)為（2.02±0.01）lg（CFU/g），符合要求。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，接種腐敗菌魚(yú)肉的菌落總數(shù)均明顯高于對(duì)照組。S1 處理組樣品在貯藏末期的菌落總數(shù)增長(zhǎng)緩慢，可能由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，樣品中的菌落生長(zhǎng)逐漸趨于穩(wěn)定，從而維持在相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)量級(jí)。第5 天時(shí)，接種腐敗菌鱸魚(yú)樣品的菌落總數(shù)均超過(guò)6.0lg（CFU/g），樣品已腐敗。不同菌株的生長(zhǎng)情況會(huì)隨貯藏時(shí)間呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），這可能與不同菌種的致腐機(jī)制有關(guān)。P1 組樣品的菌落總數(shù)在貯藏末期達(dá)（9.1l±0.05）lg（CFU/g），處于高度腐敗狀態(tài)。從圖中還可看出，各接種腐敗菌樣品的菌落總數(shù)在5 d 后處于生長(zhǎng)平緩期。這可能由于鱸魚(yú)魚(yú)肉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消耗，導(dǎo)致有機(jī)酸、胺類(lèi)物質(zhì)等代謝產(chǎn)物的積累，從而抑制其生長(zhǎng)[25]。

圖4 冷藏條件下接種腐敗菌的鱸魚(yú)肉的TVB-N 值變化Fig.4 TVB-N values of the Lateolabrax japonicus inoculated with spoilage bacteria during chilled storage

圖5 冷藏條件下接種腐敗菌的鱸魚(yú)魚(yú)肉的TVC 值變化Fig.5 TVC values of Lateolabrax japonicus inoculated with spoilage bacteria during chilled storage

2.4 腐敗能力分析

由于不同腐敗菌所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同，即生長(zhǎng)代謝存在一定差異，因此將菌落總數(shù)與揮發(fā)性鹽基氮相結(jié)合，通過(guò)產(chǎn)量因子Y（TVB-N/CFU）定量表征各優(yōu)勢(shì)腐敗菌的腐敗能力。

從表5可看出，通過(guò)YTVB-N可判斷希瓦式菌屬的致腐能力高于假單胞菌屬，這可能由于希瓦式菌屬在對(duì)冷藏淡水鱸魚(yú)魚(yú)肉的利用特性上強(qiáng)于假單胞菌屬，其分解魚(yú)肉中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有所不同，魚(yú)肉腐敗程度也有所差異。現(xiàn)有研究表明，希瓦式菌屬（Shewanella sp）是水產(chǎn)品腐敗菌中的一種，其腐敗活性強(qiáng)，能把氧化三甲胺還原成三甲胺，產(chǎn)生硫化氫等揮發(fā)性氣體[26]。此外，S1的致腐因子是16.30×10-8mgTVB-N/CFU、S2 的致腐因子是14.84×10-8mgTVB-N/CFU，兩者無(wú)顯著差異，表明其同源性很近，這與分子鑒定結(jié)果相符合。冷藏鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌中，假單胞菌屬中草莓假單胞菌屬的致腐能力要強(qiáng)于一般假單胞菌屬，從P1、P2與P3 的產(chǎn)量因子大小可分析得出。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)冷藏鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離、篩選與鑒定，觀(guān)察菌落菌落形態(tài)，做生理生化實(shí)驗(yàn)與16SrDNA 序列分析。所篩選的優(yōu)勢(shì)腐敗菌中，有1株假單胞菌屬（Pseudomonas sp.WCS374），2 株草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi P121、Pseudomonas fragi B-727）和2 株希瓦式菌屬（Putrefaciens Shewanella、Shewanella baltica OS185）。

表5 各種腐敗菌的TVB-N 產(chǎn)量因子Table 5 Yield factors of TVB-N of different spoilage bacteria

將篩選所得5 株菌株分別接種到滅菌鱸魚(yú)魚(yú)塊上，置于4 ℃條件下貯藏，通過(guò)TVB-N 產(chǎn)量因子（YTVB-N）比較得出，冷藏鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌中，希瓦式菌屬細(xì)菌的致腐能力強(qiáng)于假單胞菌屬；假單胞菌屬中，草莓假單胞菌的致腐能力強(qiáng)于一般假單胞菌。