茶葉藥理成分抑制口腔致病菌的作用及機制

顧瑩婕 金恩惠 李 博 何普明 吳媛媛 屠幼英

（浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院茶學系 杭州310058）

我國人群中口腔健康狀況不容樂觀，患齲率逐年上升，牙齦出血、牙周炎等問題普遍發(fā)生[1]。齲齒、牙周炎、口臭等口腔疾病主要由致病菌引起[2]，嚴重影響人體健康和社會交往。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）和遠緣鏈球菌（Streptococcus sobrinus）為主要致齲菌，通過分泌葡糖基轉(zhuǎn)移酶分解糖產(chǎn)酸，導致牙齒脫礦引發(fā)齲齒[3-4]。牙齦卟琳單胞菌（Porphyromonas gingivalis）與中間普氏菌（Prevotella intermedia）分泌促炎因子引起牙周炎[5-6]。具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）和Solobacterium moorei 誘導產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物引起口臭[7-8]。白色念珠菌（Canidia Albicans）可誘發(fā)口腔扁平苔蘚病[9]。

廣譜抗生素和化學合成藥雖可有效殺滅口腔致病菌，但也會對口腔微生態(tài)造成不同程度的破壞，引起菌群失調(diào)及潰瘍等問題[10]。開發(fā)低毒、高效的天然植物藥具有重要的研究意義。茶葉含有茶多酚等天然抑菌成分，并被臨床研究證實具有防治口腔疾病的作用。Ooshima 等[11]用烏龍茶提取物連續(xù)沖洗志愿者的口腔，1 周后牙菌斑沉積量明顯減少。Awadalla 等[12]用2%綠茶溶液沖洗牙科病人口腔后變形鏈球菌數(shù)目下降20.9%，牙齦出血指數(shù)GBI 降低52.5%，證實了綠茶的抗菌防齲齒效果。杜德順等[13]通過給兒童飲用含茶飲料，兩年后研究結果顯示：飲茶組兒童患齲率明顯降低。王萍[14]將復方茶多酚含漱液局部應用于牙周炎患治療中，發(fā)現(xiàn)齦下菌斑微生物量減少29.9%，齦溝液內(nèi)毒素含量降低73.8%，牙周炎治療效果顯著提高。此外，茶多酚對于復發(fā)性口腔潰瘍患者具有縮短病程，減少潰瘍數(shù)目，延長復發(fā)周期的效果[15]。

基于茶葉在防治口腔疾病中的優(yōu)異性，筆者系統(tǒng)探討了茶藥理成分對口腔主要致病菌的作用效果，著重討論其抑菌的分子作用機制，為進一步高效利用提供思路和方向。

1 茶葉藥理成分抑制口腔致病菌的作用

1.1 兒茶素類

茶多酚最早被研究證實具有預防齲病的功效，其對致齲菌如變形鏈球菌、粘性放線菌，口腔致臭菌如中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌均有較好的抑制效果[16]。2005年，王琳[17]和劉建國等[18]的研究顯示茶多酚對致臭菌的作用極佳，可望用于治療口臭。隨著分離純化技術的日趨成熟，茶多酚的主要成分——兒茶素單體類成為研究的焦點。茶多酚及兒茶素抑制口腔細菌的作用效果見表1。從最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）來看，不同菌株對藥物的敏感性存在差異，兒茶素單體特別是EGCG 對于革蘭氏陽性菌的抑制活性尤其強烈。

表2 茶黃素對不同口腔致病菌的MIC 與MBC 值Table 2 MIC and MBC value of theaflavins on different oral pathogens

1.2 茶黃素類

茶黃素（TFs）是茶葉加工過程中多酚類化合物氧化形成的一類具有苯并卓酚酮結構的物質(zhì)，其中茶黃素（TF）、茶黃素-3-單沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3’-單沒食子酸酯（TF-3’-G）和茶黃素-3，3’-雙沒食子酸酯（TF-3，3’-G）為4 種主要的單體成分。隨著茶黃素單體成分分離制備技術的日趨成熟，國內(nèi)外學者針對茶黃素的抑菌功效開展相關研究。2013年，Shahzad 等[19]發(fā)現(xiàn)茶黃素在質(zhì)量濃度0.125 mg/mL 可有效抑制鏈球菌、伴防線放線桿菌、具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的生長；Sitheeque 等[20]研究證實茶黃素對真菌如白色念珠菌也有一定的抑制作用。茶黃素抑制口腔致病菌的作用效果見表2。

表2 茶黃素對不同口腔致病菌的MIC 與MBC 值Table 2 MIC and MBC value of theaflavins on different oral pathogens

1.3 茶皂素

目前有關茶皂素對口腔致病菌的研究相對較少。2007年，黎先勝[21]用管碟法研究了茶皂素的體外抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其對白色念珠菌的抑制效果明顯，最小抑菌質(zhì)量濃度僅為0.0625 mg/mL。2013年，Joshi 等[22]成功分離茶籽皂苷中的S1、S2、S3、S44 個組分對白色念珠菌均有良好的抑菌效果。2015年，Kim 等[23]發(fā)現(xiàn)綠茶籽總皂苷及6 個皂苷組分可有效抑制變形鏈球菌生長，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL。以假絲酵母菌、白色念珠菌引起的口腔真菌感染可引起口腔內(nèi)局部炎癥、腫脹疼痛、潰瘍和紅斑以及味覺異常和口腔黏膜增生等[24]，而茶皂素由于對白色念珠菌的優(yōu)異抗性，可應用于多種口腔疾病的治療。

1.4 其它組分

茶葉精油主要是由單萜、倍半萜及其相應醇組成的萜烯類化合物。1993年，Muroi 等[25]研究發(fā)現(xiàn)綠茶精油中倍半萜類 （δ-杜松萜烯和β-石竹烯）具有抗變形鏈球菌活性，與吲哚聯(lián)用可呈現(xiàn)協(xié)同增效的作用。

2 兒茶素及茶黃素的抑菌機制

茶葉中的兒茶素及茶黃素類最為廣泛地用于各類抑菌試驗和臨床研究，其對于口腔致病菌的作用機理主要可歸納為以下幾個方面：

2.1 抑制口腔致病菌粘附口腔細胞和生物膜形成

口腔內(nèi)牙菌斑是一個復雜的細菌生物膜群體，其組成與細菌的粘附和共聚密切相關[26]。有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素濃度對變形鏈球菌生長及粘附的抑制呈相關性，當兒茶素質(zhì)量分數(shù)在0.125%～1.000%時，菌斑的形成能力及菌粘附能力顯著減弱[27-28]。1996年，Sakanaka 等[29]比較了各兒茶素單體成分對牙齦卟啉單胞菌的作用，發(fā)現(xiàn)具有沒食子酰基的EGCG 單體抑制卟啉單胞菌生長及其粘附口腔上皮細胞的效果最佳。2015年，Morin 等[30]證實了質(zhì)量濃度在125～250 μg/mL 區(qū)間的EGCG可顯著抑制Solobacterium moorei 粘附口腔上皮細胞，并減少細菌生物膜的形成。生物膜的形成在變形鏈球菌細胞的致齲毒性中很關鍵[31]。據(jù)Xu[32]研究顯示，31.25 mg/mL 的EGCG 在1 h 內(nèi)可使變形鏈球菌UA159 的粘附抑制率達到79.57%，作用2 h 可達98.33%。另外，具核梭桿菌在生成引起破壞性牙周炎的致病性齦下生物膜中起關鍵作用，而62.5 μg/mL 的EGCG 可減少55.4%的生物膜形成并隨著時間的延長破壞更嚴重，效果高于氯已定[33]。

2.2 破壞細菌結構引發(fā)細胞內(nèi)含物滲漏

早在1993年就有研究證實EGCG 可引起脂質(zhì)體內(nèi)包裹的小分子發(fā)生滲漏，產(chǎn)生細菌脂質(zhì)體和細胞聚集簇[34]。2009年，Sitheeque 等[35]的電鏡掃描結果顯示：暴露于兒茶素和茶黃素的白色念珠菌表面呈現(xiàn)一種“桑果樣”褶皺狀態(tài)，傾向于細胞壁完全塌陷。2010年，Cho[36]發(fā)現(xiàn)經(jīng)茶多酚處理的口腔致病菌都表現(xiàn)出巨大的形態(tài)學變化，鏈球菌呈現(xiàn)不規(guī)則狀細胞聚集體。2012年，Cui 等[37]利用原子力顯微鏡圖像觀察到變形鏈球菌在1/8 MIC的EGCG 處理1 h 后變得起皺，表面粗糙度增加；在1/2 MIC 的EGCG 處理后細胞表面結構凸起，留下一些碎屑。2014年，Asahi 等[38]用電鏡直接觀察到EGCG 處理后的牙齦卟啉單胞菌細胞膜損傷且細胞內(nèi)含物外泄。

多酚類物質(zhì)具有多種抗菌活性機制，包括與細菌蛋白質(zhì)和細胞壁結構相互作用，引起細胞質(zhì)膜損傷，降低膜流動性，抑制核酸合成、細胞壁合成或能量代謝等[39]。Fathima 等[40]從誘導產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）的角度闡釋了兒茶素破壞細菌細胞膜脂雙層及改變其通透性的抑菌機制。而關于細菌細胞壁的破壞，Cui 等[37]認為EGCG 對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的作用存在差異，對革蘭氏陽性菌的細胞壁聚集及損傷是通過與肽聚糖層直接結合，而其對革蘭氏陰性細菌的破壞主要是由于H2O2的產(chǎn)生誘導。

2.3 抑制細菌產(chǎn)酸及產(chǎn)酸酶活性

口腔致病菌可通過代謝產(chǎn)生有毒終產(chǎn)物，如丁酸、丙酸、苯乙酸等，這些物質(zhì)分子質(zhì)量小，在較低濃度下便可破壞宿主細胞防御系統(tǒng)。2004年，Sakanaka 等[41]發(fā)現(xiàn)EGCG 可有效抑制卟啉單胞菌活力和產(chǎn)酸力，在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL 時完全抑制苯乙酸的產(chǎn)生。陳秀蘭等[42]研究結果也顯示，EGCG 質(zhì)量濃度大于3.13 mg/L 時可抑制變形鏈球菌產(chǎn)酸。除兒茶素外，金恩惠等[43]發(fā)現(xiàn)茶黃素也抑制致齲菌（變形鏈球菌和遠緣鏈球菌）生長和產(chǎn)酸并呈劑量效應，并認為茶黃素分子通過進入細菌蛋白的“疏水口袋”來實現(xiàn)抑菌作用。

此外，2006年Hirasawa 等[44]研究揭示，EGCG還能通過抑制產(chǎn)酸酶，如乳酸脫氫酶（LDH）的活性來抑制酸分泌。2011年，Xu 等[45]發(fā) 現(xiàn)15.6～31.25 μg/mL 質(zhì)量濃度下的EGCG 通過抑制變形鏈球菌產(chǎn)生的F1Fo-ATP 酶活性來抑制其致病性。此外，變形鏈球菌分泌的3 種將牙表面蔗糖水解合成細胞外多糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶 （即GTFB，GTFC，GTFD）分別由gtfB，gtfC，gtfD 基因編碼[46]，而EGCG 在質(zhì)量濃度15.6 mg/mL 下可分別減少gtfB，gtfC，gtfD 基因表達量60.88%，60.49%和66.37%[32]。

2.4 抑制細菌促炎及相關基因表達

牙齦卟啉單胞菌是主要的牙周炎致病菌，脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，可以滲透牙齦結締組織，誘導局部炎癥反應，導致牙周骨吸收[47]。牙齦卟啉單胞菌通過LPS 刺激MMPs mRNA 的表達，促使成纖維細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）。Wen 等[48]的試驗表明，添加5 mmol/L EGCG 后的1 mg/mL LPS 所增強的MMP-1 產(chǎn)生量顯著降低；此外，EGCG 也劑量依賴性減弱LPS 增強的IL-6 mRNA 的表達。有趣的是，Yun等[49]的試驗結果顯示EGCG 對單獨MMPs 的基因表達幾乎沒有影響，而對經(jīng)牙齦卟啉單胞菌刺激的成骨細胞衍生的MMP-2，MMP-9 和MMP-13的基因表達具有顯著的降低作用，最低抑制濃度僅為20 μmol/L。Kong 等[50]在其牙齦成纖維細胞侵染模型中發(fā)現(xiàn)茶黃素可以抑制牙齦卟啉單胞菌膠原酶對I 型膠原蛋白的降解活性，并通過抑制金屬蛋白酶MMP-1 和MMP-2 的表達和分泌來降低危害。類似地，Bedran 等[51]在菌體脂多糖誘導的炎癥模型中發(fā)現(xiàn)茶黃素還可以通過減少口腔表皮細胞白介素-8 分泌和增加抗菌肽hBD-1、hBD-2和hBD-4 分泌來實現(xiàn)抗菌效果。

半胱氨酸蛋白酶包括Rgp 和Kgp 作為牙齦卟啉單胞菌分泌的重要毒力決定簇，可以引發(fā)巨噬細胞的促炎反應，導致腫瘤壞死因子α（TNFα）和白細胞介素8（IL-8）的分泌[52]，其活性也受到兒茶素及其衍生物的抑制，測定的IC50值最低僅為3 μm[53]。Jade 等[54]證實了EGCG 是兒茶素類中抑制效果最佳的單體，其在質(zhì)量濃度62.5 mg/mL 時使RgpA 和Kgp 的表達量分別下降62.4%和51.6%，并認為此種抑制是通過干擾細菌間群體反應而進行調(diào)節(jié)的。

2.5 抑制細菌產(chǎn)臭及產(chǎn)臭酶活性

具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌等致臭菌大量存在于患者牙周袋，代謝口腔中殘留的半胱氨酸，產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物。而兒茶素類單體物質(zhì)在2.5～25 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可抑制這類反應[55]，EGCG 效果最佳，其在2 000 μg/mL 時減少具核梭桿菌刺激的H2S 產(chǎn)生量約72.5%[33]。此外，兒茶素還能抑制形成H2S 的關鍵酶活性，如牙齦卟啉單胞菌通過METase 酶促L-甲硫氨酸產(chǎn)生大量的甲硫醇并引發(fā)口臭，而31.25 μg/mL EGCG 可使METase 酶轉(zhuǎn)錄基因mg1 的表達量減少56%，在46.87 μg/mL 質(zhì)量濃度時也具有類似的下調(diào)作用并且抑制METase 蛋白表達55.2%[56]。Morin 等[57]研究證實EGCG 還能顯著降低Solobacterium moorei產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物的關鍵酶——β 半乳糖苷酶的基因表達。

一般認為兒茶素類物質(zhì)抑制口腔致病菌的作用與結構中的B 環(huán)沒食子?；虲 環(huán)的羥基化程度密切相關。EGCG 中連苯三酚 （3，4，5-三羥基） 結構的存在增加了兒茶素的抗菌活性，這與Shahzad 等[58]對48 種多酚類物質(zhì)對牙周致病菌的研究結果一致。最近，Hui 等[59]研究證實茶黃素非競爭性抑制細菌萜類合成途徑的第1 個限速酶1-脫氧木酮糖-5-磷酸異構酶（DXR），分子模擬結果顯示茶黃素-3，3'-雙沒食子酸酯分子中的羥基與DXR 蛋白中的氨基酸殘基Lys36、Asp56、Glu339、Gln81、Val101 和Arg385 之間形成氫鍵和強作用力，該結果驗證了Shahzad[60]認為茶黃素的抑菌作用也來自于其酚性羥基的猜想。

3 茶藥理成分與其它天然成分、藥物聯(lián)合應用

隨著茶藥理成分對口腔致病菌作用研究的深入，許多學者將一些天然成分與其聯(lián)用，以實現(xiàn)協(xié)同增效的目的。2004年，黃曉晶等[60]將茶多酚與木糖醇聯(lián)用后抑制菌斑形成的效果與洗必泰相當，顯著優(yōu)于兩種成分單獨使用時的效果，且具有良好的口感。2006年，Masuda[61]將紅茶提取物與異硫氰酸酯聯(lián)用后可顯著抑制變形鏈球菌的蔗糖依賴性粘附作用。2011年，盧國英[62]開展了茶多酚與抗微生物制劑葡萄柚提取物（GSE）配伍使用來抑制變形鏈球菌致齲的研究，結果顯示：當兩者質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL 和37.5 mg/L 時，能有效抑制變形鏈球菌的生長、產(chǎn)酸、分泌胞外多糖和粘附的能力。張微云等[63]研究結果顯示，將茶多酚與維生素C 混合使用可協(xié)同增效，顯著抑制牙齦卟啉單胞菌生長及口臭患者唾液細菌產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物，且治療效果接近臨床藥物氯己定。2016年，許秀秀等[64]發(fā)現(xiàn)茶多酚與檸檬提取物的聯(lián)用對變形鏈球菌的體外抗菌活性具有相加作用，并能降低菌體粘附力。此外，氯化鈉、有機酸類包括酒石酸、檸檬酸、EDTA 等均被報道與茶多酚聯(lián)用可增強抑菌效果[65-66]。上述與茶多酚聯(lián)用的天然成分，主要是在一定程度上保持了茶多酚的穩(wěn)定性，從而具有增效功能。

為降低醫(yī)療藥物的用量及其副作用，避免過度消費抗生素導致的口腔超感染，在藥物中添加茶葉理化成分已成為疾病治療的常見方法。2011年，何松霖等[67]通過調(diào)整茶多酚和抗口臭成分鋅離子的體積比，可有效抑制牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和具核酸桿菌產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物。楊暤等[68]結果顯示，茶多酚與抗菌藥物奧硝唑配伍使用，對牙周致病菌放線菌屬細菌的抑制作用加強，這為牙周藥物治療的臨床合理用藥提供了依據(jù)。Bedran 等[51]將甲硝唑與紅茶提取物及茶黃素聯(lián)用，Jade 等[54]將甲硝唑與綠茶提取物及EGCG 聯(lián)用，均對牙齦卟啉單胞菌具有顯著的抑制生長和粘附作用，藥物間協(xié)同作用明顯，增強抗菌效果的同時降低甲硝唑使用濃度，減少對患者的不良反應。

由此可見，茶多酚、茶黃素可與多種物質(zhì)聯(lián)用，實現(xiàn)更好的抑菌效果。這些研究提示茶藥理成分未來可在天然產(chǎn)物開發(fā)和臨床藥物輔助等方面被進一步挖掘和提升。

4 展望

上述體外研究提供的證據(jù)表明，茶葉藥理成分抗菌活性強，與抗生素及臨床藥物聯(lián)用可達到更有針對性的效果。將綠茶、白茶、花茶提取物及茶多酚添加于牙膏中，具有天然健康、綠色安全的優(yōu)勢。茶多酚以漱口液的產(chǎn)品形式，去除部分致臭菌和口腔殘留致臭底物，并抑制致齲菌、牙周致病菌的增長，逐漸在日常生活中得到普及。深入開發(fā)茶葉藥理成分并與其它抗菌劑聯(lián)用，研制出一系列安全、實用、有效的口腔專科產(chǎn)品，拓寬茶葉藥理成分在口腔醫(yī)學領域的應用，具有深遠的意義。