不同發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中風(fēng)味物質(zhì)釋放及有害生物胺控制的影響

王德寶 趙麗華 田建軍 趙富元 呂金積 張海榮 靳 燁*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 內(nèi)蒙古呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古蒙元寬食品有限公司 內(nèi)蒙古古巴彥淖爾015000 3 內(nèi)蒙古晶鑫食品有限公司 內(nèi)蒙古古巴彥淖爾015000）

發(fā)酵香腸在市場上占有份額較少，因其呈現(xiàn)出誘人的玫瑰色、獨特的風(fēng)味而深受消費者的青睞，然而其食品安全問題也備受關(guān)注。發(fā)酵香腸是指將絞碎的瘦肉與丁狀脂肪及輔料混勻后灌入腸衣，經(jīng)自然或添加外源發(fā)酵劑發(fā)酵、干燥成熟制成pH 值低于安全酸度5.3 的一類發(fā)酵肉制品[1-3]。pH、風(fēng)味物質(zhì)等變化離不開糖類、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分解氧化[4]。封麗[5]、陳肖等[6]研究了腌制劑、脂肪酶中式香腸風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的貢獻作用。Toldra等[7]研究發(fā)現(xiàn)干腌火腿中絕大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)因脂類而自動氧化形成。蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生游離氨基酸經(jīng)脫羧、脫氨或羰基等作用，可產(chǎn)生一系列具有良好嗅感的物質(zhì)[8]。游離氨基酸也是生物胺類物質(zhì)主要前體，SILLA[9]研究表明少量生物胺對人體具有重要功能和生理調(diào)控，若體內(nèi)積累過量則會導(dǎo)致機體不適，嚴重會危及生命。Armagan[10]研究發(fā)現(xiàn)過量生物胺與肉制品中殘留亞硝酸鹽易形成具有強致癌作用的亞硝胺物質(zhì)。良好的風(fēng)味不僅可賦予香腸良好品質(zhì)，也可增加消費者購買欲望。同時肉制品食用安全性也引起廣泛關(guān)注。提高香腸良好風(fēng)味物質(zhì)含量及控制香腸有害生物胺含量尤為重要。本試驗通過添加植物乳桿菌與肉葡萄球菌發(fā)酵劑，探究在發(fā)酵香腸加工過程，發(fā)酵劑對風(fēng)味物質(zhì)釋放及有害生物胺控制的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料肉（m原料肉∶m羊肉，肥瘦比為1∶4），源自內(nèi)蒙古巴彥淖爾烏拉特蘇尼特羊后腿及羊尾。腸衣：25～30 mm 羊小腸。

發(fā)酵劑：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）與肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品微生物實驗室提供。

主要藥品：硝酸鈉、亞硝酸鈉（分析純），上海國藥集團；單磺酰氯、組胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺和1，7-二氨基庚烷（色譜級），美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、正己烷及丙酮（色譜級），上海安譜實驗科技股份有限公司。

主要儀器與設(shè)備：1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；HD-3A 型智能水分活度測量儀，深圳市銀都科技有限公司；TCP2 全自動測色色差計，北京奧依克光電儀器；Master DHS 動態(tài)頂空進樣器，美國Thermo 科技有限公司；GC-MS DSQ II 單四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo 公司；TG16-WS 臺式高速離心機，湖南離心機儀器有限公司；LRH-250-HS 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，沈陽亮衡天平儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵香腸工藝配方[3]配方：羊后腿肉80%、羊尾肥膘20%、蔗糖0.5%、食鹽2.5%、亞硝酸鈉70 mg/kg、葡萄糖0.5%、硝酸鈉100 mg/kg、抗壞血酸0.05%、發(fā)酵劑107CFU/g。

發(fā)酵香腸加工條件見表1。

表1 發(fā)酵香腸加工條件Table 1 The processing conditions of fermented sausage

1.2.2 試驗設(shè)計 通過預(yù)試驗及單因素模擬試驗，獲得發(fā)酵劑植物乳桿菌與肉葡萄球菌最佳復(fù)配比1∶2。試驗共分3 組：第1 組為對照組（不加外源發(fā)酵劑），第2 組為單一植物乳桿菌，第3 組為植物乳桿菌和肉葡萄球菌復(fù)配發(fā)酵劑。樣品分別于灌腸后（0）、發(fā)酵結(jié)束（3 d）、干燥中期（6 d）、成熟（9 d）4 個工藝點各隨機抽取，并測定其理化品質(zhì)。

1.2.3 理化指標(biāo)測定 參照GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品pH 測定》、GB 5009.33-2010 《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》、GB/T5009.208-2008《食品中生物胺含量測定》測定香腸pH、亞硝酸鹽及生物胺含量[11-13]；使用HD-3A 型智能水分活度儀測定Aw。

1.2.4 風(fēng)味測定[14]氣相色譜GC 條件：色譜柱為TR-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度35 ℃，保持2 min；以4 ℃/min 升至160 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min 升至240 ℃，保持10 min。質(zhì)譜條件：接口溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，電子方式為EI，溶劑延長時間3 min，離子掃描范圍50～300 amu。DHS：保溫3 min，爐溫75 ℃，剝離時間8 min，流速40 mL/min；干燥時間1 min，流速30 mL/min；注射時間3 min，接口處溫度250 ℃，焙烤時間20 min，流速80 mL/min，傳送帶溫度200 ℃，轉(zhuǎn)化閥200 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和SPSS19.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著，同組不同制作時間差異性用大寫字母表示，同一時間不同組間差異用小寫字母表示，相同字母表示不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸品質(zhì)影響

2.1.1 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸pH 的影響 由圖1可知，灌腸后0 d，3 組發(fā)酵香腸pH 值均為5.8，與新鮮原料肉酸度值相差甚微，說明在腌制過程中菌株生長活性微小，幾乎無酸產(chǎn)生。發(fā)酵過程，發(fā)酵劑通過糖酵解將碳水化合物快速分解為乳酸等小分子有機酸[15]，促使香腸pH 急劇下降；3 d 發(fā)酵結(jié)束，復(fù)配組pH（5.07）＜單一組pH（5.13）＜對照組pH（5.22）（P＜0.05）。3～6 d 干燥過程，香腸所處環(huán)境溫度、RH 急劇降為15 ℃、80%～85%，發(fā)酵劑代謝活性及產(chǎn)酸能力可能受到抑制，使pH 下降速率減緩，干燥結(jié)束復(fù)配組pH（4.74）降到組中最低，說明添加復(fù)配發(fā)酵劑可加快香腸產(chǎn)酸速率。6～9 d，隨著產(chǎn)酸速率下降及香腸中水分和酸性物不斷揮發(fā)，蛋白可能被分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)，含量增加[16-17]，使香腸pH 在成熟過程中呈上升趨勢。發(fā)酵結(jié)束，復(fù)配組香腸pH（4.94）顯著低于發(fā)酵香腸安全酸度（5.3）（P＜0.05）[18]。

2.1.2 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸水分活度（Aw）的影響 水分活度（Aw）已成為衡量食品保藏期長短的一個重要指標(biāo)，可以說Aw 是控制食品腐敗的重要因素。Aw＜0.9 時，大部分細菌生長受到抑制；Aw＜0.6 時，霉菌及耐鹽細菌代謝活性幾乎為零。從酶與Aw 關(guān)系來看，Aw 高、低影響酶促反應(yīng)底物濃度及酶構(gòu)象，Aw＜0.85 時，酶活性大幅下降[19-20]。

由圖2可知，0 d，3 組發(fā)酵香腸Aw 值均為0.97。0～3 d 發(fā)酵過程，高濕條件（RH：90%～95%）幾乎抑制香腸中水分向外擴散的可能性，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵香腸Aw 仍為0.97。3～6 d 干燥期，因香腸內(nèi)外環(huán)境溫度和RH 差，促使水分逐漸向外部環(huán)境擴散，結(jié)束時3 組Aw 分別降為0.86，0.85，0.83，且復(fù)配組Aw 值＜單一組＜對照組，表明發(fā)酵劑有助于香腸Aw 的降低。6～9 d 成熟過程，3 組香腸Aw 值持續(xù)下降，相比干燥過程，下降幅度較小，可能是由于香腸肉餡外層水分擴散速率快于內(nèi)層，導(dǎo)致外層較為干燥，阻礙了肉餡中心水分的散發(fā)；香腸發(fā)酵結(jié)束，3 組Aw 值分別降為0.80，0.79 及0.76。

圖1 發(fā)酵羊肉香腸pH 變化Fig.1 pH changes of the fermented mutton sausages

圖2 發(fā)酵羊肉香腸Aw 變化Fig.2 Changes of Aw value of the fermented mutton sausages

2.1.3 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中亞硝酸鹽的影響 亞硝酸鹽具有發(fā)色、抗氧化及防腐作用，可消除原料肉不適風(fēng)味，提高產(chǎn)品質(zhì)量[21]。然而其殘留過量會與香腸中生物胺生成具有強致癌作用的亞硝胺，是目前食品界備受關(guān)注的食品安全問題[22]。

由圖3可知，0 d 時3 組亞硝酸鹽含量均為70 mg/kg。0～3 d 發(fā)酵過程，低pH 值使部分亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸，與肌紅蛋白結(jié)合生成亞硝基肌紅蛋白[23-24]，香腸中亞硝酸鹽殘留量呈下降趨勢，3d 末復(fù)配組亞硝酸鹽含量（66 mg/kg）＜單一組（68 mg/kg）＜對照組（69 mg/kg）（P＜0.05）。干燥過程環(huán)境溫度及RH 急劇降低，使硝酸還原酶活性被抑制，3 組發(fā)酵香腸亞硝酸鹽含量急劇下降，對照組、單一組及復(fù)配組3 組含量分別為16.8，15.2，13.5 mg/kg，且3 組間差異顯著（P＜0.05）。成熟結(jié)束即為成品，復(fù)配組亞硝酸鹽殘留量（12.6 mg/kg）顯著低于其它兩組，更低于國家食品安全規(guī)定最高允許殘留量30 mg/kg[25]。

2.2 發(fā)酵香腸中生物胺

2.2.1 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中β-苯乙胺含量的影響 苯乙胺是一種芳香胺，可被單胺酶氧化分解，可有效防止其在腦部集中。Bover-cid[26]研究發(fā)現(xiàn)，精胺與亞精胺是香腸原料肉中最主要的生物胺。朱志遠等[27]試驗表明，發(fā)酵劑和成熟時間對精胺和亞精胺含量基本沒有影響。本試驗主要探究不同發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸制作過程（發(fā)酵、干燥及成熟過程）有害生物胺的抑制作用。

由圖4可知，發(fā)酵結(jié)束時復(fù)配組β-苯乙胺含量（2.81 mg/kg）＜單一組（3.83 mg/kg）＜對照組（6.89 mg/kg），且組間含量差異顯著（P＜0.05）。3～6 d 干燥過程，各組β-苯乙胺含量呈下降趨勢，對照組下降幅度最大，此時內(nèi)源酶對苯乙胺分解作用大于外源酶。6～9 d 成熟過程，較低溫度及濕度對香腸中微生物及酶代謝活性均產(chǎn)生較強抑制作用，β-苯乙胺呈上升趨勢，其中添加發(fā)酵劑兩組苯乙胺含量增加幅度高于對照組。

圖3 發(fā)酵羊肉香腸中亞硝酸鹽含量變化Fig.3 Changes of the nitrite content of the fermented mutton sausages

2.2.2 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中尸胺含量的影響尸胺雖對人體無害，但可通過抑制雙胺氧化酶、羥甲基轉(zhuǎn)化酶及脫毒酶的活性而潛在增加組胺含量及毒性[28]。

由圖5可知，3 d 發(fā)酵結(jié)束時3 組尸胺的含量較高，且對照組（9.85 mg/kg）顯著高于復(fù)配組（8.53 mg/kg）與單一組（8.40 mg/kg）（P＜0.05），單一組與復(fù)配組間尸胺含量差異不明顯（P＞0.05）。干燥過程中，各組尸胺含量呈下降趨勢，干燥結(jié)束時結(jié)果與發(fā)酵結(jié)束差異顯著（P＜0.05）。6～9 d，3組尸胺含量大幅下降，復(fù)配組含量（4.02 mg/kg）＜單一組（4.10 mg/kg）＜對照組（4.65 mg/kg），說明通過發(fā)酵、成熟及添加植物乳桿菌與肉葡萄球菌復(fù)配發(fā)酵劑能有效較低香腸中尸胺含量。

2.2.3 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中組胺含量的影響組胺是組氨酸經(jīng)脫羧酶脫羧后形成，是食品中毒性最強的胺。其毒性效果取決于組胺的吸收濃度以及其它胺的存在情況，甚至還包括胺氧化酶的活性以及個人腸內(nèi)的生理狀況。美國食品藥品管理局 （FDA） 規(guī)定食品中組胺含量＜50 mg/kg，酪胺＜100 mg/kg。歐洲在魚產(chǎn)品中規(guī)定組胺最高限量為100 mg/kg[30]。由表2可知，香腸加工前期3組香腸均未檢出組胺。成熟末期，對照組組胺含量為3.036 mg/kg，單一組為2.92 mg/kg，復(fù)配組為2.89 mg/kg，復(fù)配組＜單一組＜對照組。綜上表明，添加復(fù)合發(fā)酵劑有助于降低香腸中有害生物胺殘留。

圖4 發(fā)酵羊肉香腸中β-苯乙胺含量變化Fig.4 The content changes of β-phenylethylamine in fermented mutton sausages

圖5 發(fā)酵羊肉香腸中尸胺含量變化Fig.5 The content change of cadaverine in fermented mutton sausages

表2 發(fā)酵羊肉香腸中組胺含量變化Table 2 The content changes of histamine in fermented mutton sausages

圖6 發(fā)酵羊肉香腸中酪胺含量變化Fig.6 The content changes of tyramine in fermented mutton sausages

2.2.4 發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中酪胺含量的影響由圖6可知，發(fā)酵結(jié)束時3 組香腸酪胺含量較低，結(jié)果為對照組（6.32 mg/kg）＞單一組（2.42 mg/kg）＞復(fù)配組（2.11 mg/kg）。3～6 d 干燥過程，酪胺含量呈快速上升趨勢，干燥結(jié)束時酪胺含量顯著高于發(fā)酵結(jié)束時（P＜0.05），組間仍是對照組（15.48 mg/kg）＞單一組 （12.54 mg/kg）＞復(fù)配組 （8.07 mg/kg）。在6～9 d 成熟過程，各組酪胺含量是干燥結(jié)束時的2～3 倍，而復(fù)配組含量（22.54 mg/kg）顯著低于其它兩組。綜上表明，苯乙胺與酪胺同時產(chǎn)生，且酪胺在香腸中呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，而成熟結(jié)束各組含量均低于100 mg/kg；相比對照和單一組，復(fù)合發(fā)酵劑對酪胺含量變化有一定的抑制作用。綜觀整體，在香腸制作各階段點，成品時酪胺含量最高，與張慧超等[29]研究結(jié)果一致。

2.3 香腸中風(fēng)味物質(zhì)

香腸中風(fēng)味物質(zhì)主要源于三大營養(yǎng)物質(zhì)分解及生化反應(yīng)。碳水化合物在發(fā)酵劑作用下被分解產(chǎn)生乳酸、乙酸、琥珀酸等，可賦予香腸特殊風(fēng)味物質(zhì)；糖與蛋白質(zhì)經(jīng)過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生呋喃、吡啶、吡嗪、噻吩、噻唑、吡咯、咪唑以及環(huán)烯硫化物，是香腸產(chǎn)生肉香味主要途徑[31]。此外，肉中豐富的不飽和脂肪酸易被氧化分解產(chǎn)生酮、醛及內(nèi)酯等對香腸香味具有重要貢獻的風(fēng)味物質(zhì)[8]。風(fēng)味是評價肉制品品質(zhì)特征的重要因素，良好的風(fēng)味不僅可賦予香腸良好品質(zhì)，也可增加消費者購買欲望。

表3 發(fā)酵羊肉香腸中風(fēng)味物質(zhì)相對含量Table 3 Relative contents of volatile flavor compounds in fermented mutton sausages

由表3可知，通過添加植物乳桿菌與肉葡萄球菌制作發(fā)酵香腸，在香腸成熟結(jié)束即為成品時共鑒定出26 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括醇類5種，醛類4 種，酯8 種，酸類3 種，烴類5 種及醚類1 種。從對照組共檢出15 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類1 種，醛類2 種，酯6 種，酸類1 種，烴類4 種及醚類1，而單一組與復(fù)配組均檢出26 中風(fēng)味物質(zhì)。比較3 組6 類風(fēng)味物質(zhì)相對含量，可知含量最為豐富是醇類，醛類次之，其次是酯類、烴類，而醚類含量最低。結(jié)果表明：復(fù)配組醇類風(fēng)味物質(zhì)含量8.90 mg/kg，單一組為8.66 mg/kg，顯著高于對照組1.27 mg/kg；復(fù)配組與單一組醛類物質(zhì)含量分別為8.04，6.24 mg/kg，遠高于對照組0.40 mg/kg。對于酯類、烴類、酸類等風(fēng)味物質(zhì)，兩發(fā)酵劑組仍高于對照組。這一結(jié)果可能與接種發(fā)酵劑有關(guān)，產(chǎn)生機理有待進一步研究。綜上可知，醇類、醛類是香腸中主要風(fēng)味貢獻物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

通過添加植物乳桿菌與肉葡萄球菌發(fā)酵劑將試驗分為3 組，探究不同發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸加工過程品質(zhì)變化、風(fēng)味物質(zhì)釋放及有害生物胺控制的影響。發(fā)酵過程復(fù)配組產(chǎn)酸速率＞單一組＞對照組，且在干燥結(jié)束時降到組中最低4.74，低于發(fā)酵香腸安全酸度5.3（P＜0.05）；隨著pH 降低，使蛋白質(zhì)對水分束縛能力下降，促使復(fù)配組Aw 下降速率快于其它兩組；低pH 可使亞硝酸鹽與肌紅蛋白間接結(jié)合，生成促進香腸顯色的亞硝基肌紅蛋白，并抑制硝酸鹽還原酶活性，成品時復(fù)配組亞硝酸鹽12.6 mg/kg，低于單一和對照兩組，更低于國家安全規(guī)定30 mg/kg[25]。

精胺和亞精胺在香腸制作過程含量變化微小，且為肉中所固有胺類物質(zhì)，未對其加以分析[27]。成品時對照組β-苯乙胺含量＜復(fù)配組＜單一組，復(fù)配組尸胺含量 （4.02 mg/kg）＜單一組（4.10 mg/kg）＜對照組（4.65 mg/kg），組胺僅在9 d 成品時檢出，且復(fù)配組（2.89 mg/kg）＜單一組（2.92 mg/kg）＜對照組（3.036 mg/kg），相比4 種生物胺，酪胺含量最高，整個過程酪胺含量呈上升趨勢，始終為復(fù)配組含量＜單一組＜對照組，其存在有助于增強組胺毒性[31]，說明添加復(fù)配發(fā)酵劑有利于抑制毒性最強組胺和酪胺的釋放，提高香腸安全性。成品時測的發(fā)酵組風(fēng)味物質(zhì)26 種，對照組僅檢出15 種，且發(fā)酵組風(fēng)味物質(zhì)含量顯著高于對照組（P＜0.01），說明添加發(fā)酵劑有助于香腸中風(fēng)味物質(zhì)釋放。

綜上可知，添加復(fù)配發(fā)酵劑不僅有利于縮短香腸發(fā)酵周期，快速降低水分含量，還有助于抑制和降低香腸中亞硝酸鹽及有害生物胺含量，提高香腸安全性和延長貨架期，增加香腸中風(fēng)味物質(zhì)種類及含量。