PLUG引物和IT引物在頂芒山羊草分子標(biāo)記建立中的通用性分析

宮文萍 李凱 程敦公 武智民 李洪振 韓冉 李豪圣 劉成 劉建軍

摘要：分子標(biāo)記是檢測和追蹤小麥背景中近緣物種染色體的重要手段。依據(jù)禾本科物種基因共線性原則，基于基因序列設(shè)計(jì)的引物在不同物種中可能具有通用性。本研究對(duì)水稻PLUG引物和簇毛麥IT引物在頂芒山羊草中的通用性進(jìn)行了分析，并建立了頂芒山羊草染色體特異IT標(biāo)記。供試的397對(duì)PLUG引物和841對(duì)IT引物對(duì)小麥-頂芒山羊草雙二倍體與中國春的擴(kuò)增結(jié)果顯示，377對(duì)（95.0%）PLUG引物和593對(duì)（70.5%）IT引物可以在供試材料中擴(kuò)增出清晰條帶。因此，PLUG引物在頂芒山羊草中的通用性優(yōu)于IT引物。相比小麥對(duì)照，PLUG引物和IT引物能在小麥-頂芒山羊草雙二倍體中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的引物數(shù)分別有17對(duì)和5對(duì)，分別占供試PLUG引物和IT引物的4.3%和0.6%。利用獲得的IT多態(tài)性引物對(duì)一套小麥-頂芒山羊草附加系和一套小麥-卵穗山羊草附加系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅引物CINAU1060、CINAU1465和CINAU1517能在相應(yīng)附加系中擴(kuò)增出大小分別約為300、480 bp和320 bp的多態(tài)性標(biāo)記，為小麥背景中頂芒山羊草染色質(zhì)的鑒定提供了新的檢測手段。然而，本研究中IT引物建立頂芒山羊草分子標(biāo)記的比率僅為0.4%，低于我們之前用PLUG引物建立頂芒山羊草分子標(biāo)記的比率（8.9%）。

關(guān)鍵詞：頂芒山羊草;分子標(biāo)記;PLUG引物;IT引物;通用性

中圖分類號(hào)：S512.103.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）07-0010-07

Abstract Molecular marker plays an important role in detecting and tracking chromosomes of related species in wheat background. According to the principle of gene collinearity in Gramineae species， primers designed based on gene sequences might be universal in different species. In this research， the universality of PLUG primers for Oryza sativa and IT primers for Dasypyrum villosum were analyzed in Aegilops comosa， and chromosome specific IT markers of Ae.comosa were established. The amplification results of 397 pairs of PLUG primers and 841 pairs of IT primers in wheat-Ae.comosa amphiploid and Chinese Spring showed that 377 pairs （95.0%） of PLUG primers and 593 pairs （70.5%） of IT primers could amplify clear bands in the tested materials. Therefore， the universality of PLUG primers in Ae.comosa was better than that of IT primers. Compared with Chinese Spring， the number of PLUG and IT primers that could amplify polymorphic bands in wheat-Ae.comosa amphiploid was 17 pairs and 5 pairs， which accounted for 4.3% and 0.6% of the PLUG and IT tested primers， respectively. In this research， a set of wheat-Ae.comosa addition and a set of wheat-Ae.geniculata addition were amplified with the obtained IT polymorphic primers. The results showed that 300， 480 bp and 320 bp in length polymorphism bands could be amplified by primers CINAU1060， CINAU1465 and CINAU1517 in relative additions， respectively， which provided new method for the identification of Ae.comosa chromatin in wheat background. However， the ratio for molecular marker development of Ae.comosa using IT primers was 0.4%， which was much lower than that of PLUG primers （8.9%）.

Keywords Aegilops comosa; Molecular marker; PLUG primer; IT primer; Universality

小麥（Triticum aestivum L.）是世界上播種面積最大、總產(chǎn)量最多和分布范圍最廣的重要糧食作物，但其病害如小麥條銹病、葉銹病和白粉病等嚴(yán)重阻礙了小麥生產(chǎn)[1]。小麥近緣物種抗病性優(yōu)異，從小麥近緣物種中將抗病基因?qū)胄←準(zhǔn)歉牧夹←溈共⌒缘闹匾椒ㄖ?。小麥近緣物種如山羊草屬（Aegilops）中的頂芒山羊草（Ae. comosa，也作Triticm comosum，2n=2x=14，基因組MM），起源于歐洲南部的希臘和土耳其等國，一年生草本植物，高抗小麥條銹病[2]、稈銹病[2]、葉銹病[3]和白粉病[4]，是小麥抗病育種的優(yōu)異基因源。小麥-近緣物種雙二倍體是向普通小麥轉(zhuǎn)育頂芒山羊草抗病性的重要橋梁[5，6]，目前，本試驗(yàn)室已鑒定獲得小麥-頂芒山羊草雙二倍體[7]以及該雙二倍體與普通小麥的雜交后代材料，然而，分子標(biāo)記的缺乏極大地限制了這批雜交后代材料的精確鑒定。

分子標(biāo)記對(duì)小麥背景中近緣物種染色體的鑒定和追蹤起到重要作用。研究證明，可依據(jù)禾本科物種基因共線性原則，根據(jù)已測序物種的基因序列開發(fā)引物用于建立另一未測序物種的分子標(biāo)記[3，6]?；谒竞痛孛溁蛐蛄械腜LUG引物[8]和IT引物[9]已經(jīng)被分別開發(fā)出來。目前，PLUG標(biāo)記不僅已經(jīng)被用于識(shí)別小麥與外源染色體的同源群[10-12]，還被用于標(biāo)記輔助選擇（MAS）、比較基因組學(xué)、異源染色體的追蹤和基因分型[10-13]。近年來，IT引物也已被用于鑒定小麥背景中的簇毛麥染色質(zhì)[9，14]。然而，這兩類引物在頂芒山羊草中的通用性還不清楚。本研究利用PLUG引物和IT引物對(duì)小麥-頂芒山羊草雙二倍體及對(duì)照小麥進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較了兩類引物在頂芒山羊草中的通用性，進(jìn)而利用一套小麥-頂芒山羊草附加系為材料，對(duì)獲得的多態(tài)性片段進(jìn)行染色體定位，建立了頂芒山羊草IT分子標(biāo)記，為小麥背景中頂芒山羊草染色質(zhì)的檢測提供了新的手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

24份供試材料的相關(guān)信息列于表1，其中，小麥中國春由電子科技大學(xué)（University of Electronic Science and Technology of China， UESTC）楊足君教授提供。序號(hào)2—13的材料由英國John Innes Centre（JIC）的Reader S.M.教授提供。序號(hào)14—20的材料由美國堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳與基因資源中心（Wheat Genetics Resource Center， WGRC）的Friebe B.教授提供。序號(hào)21—24的材料由本實(shí)驗(yàn)室（Current Lab， CL）育成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

供試材料基因組總DNA用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取。取約100 mg的葉片放入2 mL離心管（提前加入直徑2 mm的鋼珠）中，液氮中速凍，然后用SCIENTZ-192組織研磨機(jī)在30 Hz頻率下將葉片打碎至粉末，加入400 μL緩沖液FP1和6 μL的TNase，漩渦振蕩1 min，室溫放置10 min。然后加入130 μL緩沖液FP2，輕輕混勻，渦旋振蕩1 min。12 000 r·min-1離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入70%體積的異丙醇，充分混勻，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，保留沉淀。加入500 μL 70%乙醇洗滌DNA，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，再次用500 μL 70%乙醇洗滌一次，步驟與第一次相同。晾干后加入TE溶解DNA備用。

1.2.2 ?PLUG引物與IT引物的PCR擴(kuò)增及電泳分析

397對(duì)PLUG引物根據(jù)水稻基因序列設(shè)計(jì)，染色體第一到第七同源群引物分別為51、55、63、54、61、59、54對(duì)，引物序列及PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[11]，PLUG引物由成都瑞信生物公司合成。841對(duì)IT引物根據(jù)簇毛麥基因內(nèi)含子區(qū)多態(tài)性設(shè)計(jì)[9，14]，染色體第一到第七同源群引物分別為135、175、120、89、140、71、111對(duì)，擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[9]。IT引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成。

PLUG-PCR和IT-PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后凝膠在紫外凝膠成像儀GDS-Gel Dol 2000下掃描照相。用凝膠成像系統(tǒng)的Quality One軟件進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，同時(shí)人工統(tǒng)計(jì)條帶與軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果相互核實(shí)印證。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLUG引物和IT引物的擴(kuò)增結(jié)果

用397對(duì)PLUG引物對(duì)小麥-頂芒山羊草雙二倍體和中國春基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，377對(duì)（95.0%）引物可以在供試材料中擴(kuò)增出清晰條帶，其中，引物TNAC1083、TNAC1087、TNAC1019、TNAC1142和TNAC1318的擴(kuò)增效果如圖1所示。每對(duì)PLUG引物的擴(kuò)增條帶數(shù)1～7條不等，片段大小90～1 800 bp，共擴(kuò)增出642條清晰條帶，平均擴(kuò)增條數(shù)為1.62條（表2）。

用841對(duì)IT引物對(duì)小麥-頂芒山羊草雙二倍體和中國春基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示， 593對(duì)（70.5%）引物能在供試物種中擴(kuò)增出清晰條帶，其中，引物CINAU849、CINAU853、CINAU948、CINAU1041和CINAU1438的擴(kuò)增效果如圖1所示。每對(duì)IT引物的擴(kuò)增條帶數(shù)1～6條不等，片段大小80～1 500 bp，共擴(kuò)增出803條清晰條帶，平均擴(kuò)增條數(shù)為1.35條（表2）。

2.2 頂芒山羊草特異PLUG和IT片段

能在供試材料中擴(kuò)增出清晰條帶的377對(duì)PLUG引物中，相比對(duì)照小麥中國春、濟(jì)麥23、濟(jì)麥44、濟(jì)麥229和濟(jì)麥262，TNAC1017、TNAC1204和TNAC1364等17對(duì)引物能在小麥-頂芒山羊草雙二倍體中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，其中，引物TNAC1296和TNAC1920各擴(kuò)增出2個(gè)多態(tài)性條帶，其余引物均擴(kuò)增出1個(gè)多態(tài)性條帶，共計(jì)獲得19個(gè)頂芒山羊草的特異性片段，獲得多態(tài)性引物比例為4.3%（17/397）。所獲19個(gè)多態(tài)性片段大小220～1 400 bp不等，目前這些多態(tài)性標(biāo)記已經(jīng)被應(yīng)用于小麥-頂芒山羊草雜交種質(zhì)的鑒定中[15]。

能在供試材料中擴(kuò)增出清晰條帶的593對(duì)IT引物中，相比中國春、濟(jì)麥23、濟(jì)麥44、濟(jì)麥229和濟(jì)麥262，CINAU883、CINAU1060、CINAU1067、CINAU1465和CINAU1517共5對(duì)引物能在小麥-頂芒山羊草雙二倍體中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，5對(duì)引物分別擴(kuò)增出1個(gè)多態(tài)性條帶，共獲得5個(gè)頂芒山羊草的特異性片段，獲得多態(tài)性引物比例為0.6%（5/841）。其中，CINAU1465和CINAU1517的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

2.3 頂芒山羊草染色體特異IT分子標(biāo)記的建立

因?yàn)轫斆⑸窖虿莸腗染色體組是卵穗山羊草Mg染色體組的供體[16]，所以本研究同時(shí)利用小麥-頂芒山羊草2M-7M附加系和小麥-卵穗山羊草1Mg-7Mg附加系對(duì)上述多態(tài)性片段外進(jìn)行染色體定位。利用引物CINAU883、CINAU1060、CINAU1067、CINAU1465和CINAU1517對(duì)上述兩套附加系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)簇毛麥2VL上基因序列設(shè)計(jì)的引物CINAU1060僅能在頂芒山羊草2M和卵穗山羊草2Mg染色體擴(kuò)增出片段長度約為300 bp的目標(biāo)片段（表3）;根據(jù)簇毛麥5VS上基因序列設(shè)計(jì)的引物CINAU1465僅能在頂芒山羊草6M（表3，圖2A）和卵穗山羊草5Mg染色體擴(kuò)增出片段長度約為480 bp的目標(biāo)片段（表3）;根據(jù)簇毛麥6VL上基因序列設(shè)計(jì)的引物CINAU1517僅能在頂芒山羊草6M（表3，圖2B）和卵穗山羊草5Mg染色體擴(kuò)增出片段長度約為320 bp的目標(biāo)片段（表3）。

本研究篩選了841對(duì)IT引物，獲得頂芒山羊草2M染色體特異標(biāo)記1個(gè)和6M染色體標(biāo)記2個(gè)（表3），獲得標(biāo)記比例約為0.4%（3/841），遠(yuǎn)低于我們之前利用PLUG引物建立頂芒山羊草染色體特異標(biāo)記8.9%的比例（表2）。本研究中，CINAU1465和CINAU1517均分別能在頂芒山羊草6M和卵穗山羊草5Mg染色體上擴(kuò)增出特異目標(biāo)多態(tài)性片段，這表明頂芒山羊草和卵穗山羊草染色體可能存在5/6重組。

3 討論

3.1 水稻PLUG引物在小麥族不同物種中的通用性及分子標(biāo)記建立中的應(yīng)用

Ishikawa等[8，16]最早利用水稻單拷貝基因序列開發(fā)設(shè)計(jì)獲得PLUG引物，用于有效分選基因產(chǎn)物，是大規(guī)模標(biāo)記開發(fā)的有效工具。其后，Li等[17]建立了長穗偃麥草染色體第七同源群的PLUG標(biāo)記，用于鑒定小麥-長穗偃麥草附加系材料1—27，分子標(biāo)記獲得比例為5.4%。Li等[18]建立了帝國黑麥染色體特異PLUG標(biāo)記79個(gè)， 分子標(biāo)記獲得比例為54.9%。Lang[10]和Hu[19]等分別篩選PLUG引物建立了中間偃麥草特異PLUG標(biāo)記，用于鑒定小麥-中間偃麥草雜交種質(zhì)，分子標(biāo)記獲得比例分別為82.0%和84.9%。Li[20]和Liu[21]等分別建立了多年生簇毛麥染色體不同同源群PLUG標(biāo)記用于鑒定小麥-多年生簇毛麥染色體系，分子標(biāo)記獲得比例41.7%和10.7%。Liu等[22]建立了無芒山羊草染色體特異PLUG標(biāo)記，分子標(biāo)記獲得比例為6.9%。上述實(shí)例表明，PLUG引物在小麥族不同物種中的通用性及分子標(biāo)記建立獲得率相差較大，上述物種中，PLUG引物在黑麥和偃麥草標(biāo)記建立方面優(yōu)于其他物種，且對(duì)同一物種而言隨著PLUG引物對(duì)用量的多少其建立物種分子標(biāo)記的獲得比例也可能發(fā)生變化。因?yàn)楸狙芯堪l(fā)現(xiàn)，供試的397對(duì)PLUG引物中，有17對(duì)可以用于建立頂芒山羊草染色體特異分子標(biāo)記，獲得多態(tài)性比例僅為4.3%，而篩選更多量的PLUG引物（526對(duì)）建立頂芒山羊草分子標(biāo)記的比例反而增加到了8.9%，這可能是因?yàn)樗綪LUG與小麥族物種不同染色體同源群EST同源性有所差異造成的。

3.2 簇毛麥IT引物在頂芒山羊草中的通用性及分子標(biāo)記建立中的應(yīng)用

基于基因內(nèi)含子序列開發(fā)IT引物并建立物種分子標(biāo)記的工作已經(jīng)在馬鈴薯和龍葵[23]、豌豆[24]、高粱[25]和燕麥[26]等物種中報(bào)道。然而，在小麥野生近緣種中卻鮮有報(bào)道。近年來，小麥野生近緣種山羊草IT引物[27] 、簇毛麥IT引物[9，14]已逐漸被開發(fā)出來。Sheikh等[27]開發(fā)了135對(duì)IT引物，建立了粘果山羊草和易變山羊草染色體特異標(biāo)記29個(gè)，標(biāo)記獲得率為21.5%。Zhang[9]等利用開發(fā)的1 624對(duì)IT引物建立了簇毛麥染色體特異標(biāo)記841個(gè)，標(biāo)記獲得率為51.8%。Wang[14]等利用流式細(xì)胞儀對(duì)簇毛麥4VS染色體臂進(jìn)行分揀并測序，根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)了IT引物359對(duì)，建立了簇毛麥4VS特異性標(biāo)記232個(gè)，標(biāo)記獲得率為64.62%。本研究利用上述簇毛麥的841對(duì)IT引物對(duì)小麥對(duì)照和小麥-頂芒山羊草雙二倍體等物種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這批IT引物能在供試物種中擴(kuò)增出清晰條帶的占70.5%，然而，僅3對(duì)可以用于建立頂芒山羊草染色體特異IT標(biāo)記，標(biāo)記獲得率僅為0.4%，這可能是因?yàn)楸狙芯克铆傊悄z的分辨率遠(yuǎn)低于Zhang[9]和Wang[14]等所用聚丙烯酰胺凝膠所致。目前，我們正在開展利用聚丙烯酰胺凝膠建立頂芒山羊草染色體特異IT標(biāo)記工作。

3.3 頂芒山羊草特異標(biāo)記的建立

對(duì)不同引物進(jìn)行物種間通用性分析，不僅可以用于評(píng)價(jià)物種間親緣關(guān)系[27]，還可用于物種分子標(biāo)記的建立[15-21]。在頂芒山羊草特異標(biāo)記建立方面，Teoh等[28]通過C帶技術(shù)獲得不同來源頂芒山羊草的標(biāo)準(zhǔn)核型圖，即建立了頂芒山羊草細(xì)胞遺傳標(biāo)記。Wang等[29]從頂芒山羊草中發(fā)現(xiàn)一類新的對(duì)小麥面團(tuán)品質(zhì)具有正面效應(yīng)的低分子麥谷蛋白基因并開發(fā)了分子標(biāo)記。翁躍進(jìn)等[30-31]建立了頂芒山羊草M染色體組RFLP標(biāo)記40個(gè)，并將其應(yīng)用于小麥-頂芒山羊草4M（4D）異代換系的鑒定。Liu等利用水稻PLUG引物對(duì)頂芒山羊草染色體組分子標(biāo)記進(jìn)行開發(fā)，獲得頂芒山羊草染色體特異標(biāo)記44個(gè)[32]。本研究首次利用IT引物對(duì)頂芒山羊草進(jìn)行擴(kuò)增，獲得頂芒山羊草新型IT分子標(biāo)記3個(gè)，為檢測小麥背景中頂芒山羊草染色質(zhì)提供了新的檢測方法。

4 結(jié)論

PLUG引物在頂芒山羊草中的通用性優(yōu)于IT引物;頂芒山羊草染色體特異IT標(biāo)記CINAU1060、CINAU1465和CINAU1517的建立為小麥背景中頂芒山羊草染色質(zhì)的鑒定提供了新的檢測手段。

參 考 文 獻(xiàn)：

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