蝴蝶蘭成花分子生物學研究進展

宮子惠 李奧 張英杰 張京偉 孫紀霞 劉學慶

摘要：蝴蝶蘭花型獨特且高度進化，是單子葉植物中研究花發(fā)育生物學的理想材料。近年來隨著分子生物學技術的不斷提高，蝴蝶蘭成花基因的研究取得重大進展。本研究從蝴蝶蘭開花轉換和花器官形成兩方面對近年來國內外有關蝴蝶蘭花發(fā)育分子機理的研究進展進行整理與歸納， 并對蝴蝶蘭花發(fā)育需解決的問題進行探討，以期為加快分子生物學技術在蝴蝶蘭研究中的應用提供參考。

關鍵詞：蝴蝶蘭;花器官發(fā)育;成花誘導;基因;開花整合子

中圖分類號：S682.31文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）07-0161-06

蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite Rchb. F.）為蘭科蝴蝶蘭屬，又稱蝶蘭[1]，原產于亞熱帶雨林地區(qū)。蝴蝶蘭素有“洋蘭王后”之稱，尤其在新春時節(jié)，葉腋抽出長長的花梗，開出形如蝴蝶飛舞般的花朵，花形美麗別致、色彩艷麗、花期長，深受花迷們的青睞[2]。

蝴蝶蘭起源古老，花型獨特且結構高度特化，具有花瓣狀的萼片、特異的唇瓣，其雌雄蕊合生成合蕊柱并且子房發(fā)育須由授粉來啟動，是單子葉植物中研究花發(fā)育進程的理想材料[3，4]。隨著研究的不斷深入，傳統(tǒng)手段已難以對蝴蝶蘭進行更深入的探索，分子育種技術的應用顯得尤為重要?；ㄆ谡{控技術是近年來研究的熱點，但對于蝴蝶蘭成花機理和誘導途徑還不夠清晰。因此深入了解各類型蝴蝶蘭花芽分化基因的表達模式，分析其成花誘導的基本途徑以及各途徑間的交叉影響關系，對于豐富蝴蝶蘭成花理論、解決生產中的問題、推動其在中國的發(fā)展具有重要的價值和意義。

1 蝴蝶蘭花芽誘導相關基因的研究進展

植株在外界環(huán)境和遺傳因子的雙重作用下，控制成花的相關基因在時間和空間上按一定順序表達，莖頂端分生組織由營養(yǎng)生長轉變?yōu)樯成L的過程稱為成花誘導。這不僅僅是植物生長發(fā)育過程中的重要轉折時期，也是對生產產生直接影響的重要時期[5]。近年來，開花調控逐漸成為植物分子生物學研究的熱點。目前已知的高等植物成花誘導途徑共有7種，分別是光周期途徑、春化途徑、溫敏途徑、自主途徑、赤霉素途徑、年齡途徑和環(huán)境溫度途徑 [6-9]，它們既彼此獨立，又相互交織?，F已證實擬南芥中存在3個開花途徑整合因子SOC1、LFY和FT，其成花誘導途徑主要通過調節(jié)FT、SOC1和LFY等開花信號整合因子的表達水平來精確地調控花分生組織中相關基因的表達，進而調節(jié)成花轉換、控制開花時間和啟動植物的開花過程。它們擁有共同的下游目標調節(jié)基因CO和FLC，其中CO是光周期途徑的中心關鍵基因，而FLC是春化途徑和自主途徑的集合點[10]。

1.1 FT基因

FT基因是重要的開花促進基因，在植物成花過程中發(fā)揮著不可替代的作用，有‘開花素之稱。FT基因在擬南芥晚花突變體中首次被發(fā)現，它是植物開花調控途徑的中心結點基因，能夠整合來源于光周期途徑、春化途徑和自主途徑的花發(fā)育信號。在光周期調控途徑中，FT基因是關鍵因子CO下游的直接靶基因，它在葉片中表達，進而激活莖頂花序分生組織基因，從而促進花的形成。在環(huán)境溫度途徑、年齡途徑中能促進下游LFY基因的表達，在春化途徑和自主途徑中，FT基因是FLC基因的靶基因。由此可見FT基因在植物成花途徑的交匯節(jié)點發(fā)揮著重要作用[11-13]。

目前在蝴蝶蘭中已分離到FT的同源基因PHFT和PaFT1。Li等[14]研究發(fā)現蝴蝶蘭的FT同源基因PHFT主要在根、葉片、花等部位表達，其中在花的心皮和花瓣中的表達量最高，且幼花中的表達量高于成熟花，并且在ft-1突變擬南芥中超表達PhFT基因會導致早花及角果缺失。而Jang等[15]發(fā)現FT同源基因PaFT1主要在白蝴蝶蘭花梗和花芽中表達，且低溫能夠誘導PaFT1的表達量顯著上升，但光周期處理對其表達量無明顯影響。

1.2 SOC1基因

SOC1基因廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中，大多含有7個外顯子和6個內含子，編碼一個MADS結構域蛋白，具有典型MIKC類的MADS-box基因家族的結構特征[16]。研究表明，SOC1是一個多功能蛋白，主要調節(jié)開花時間，并且對花的類型及分生組織的發(fā)育也有調節(jié)作用[17]。前人通過基因突變及蛋白亞細胞定位技術已初步了解 SOC1所編碼蛋白的功能。SOC1基因與其它基因蛋白共同作用，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可替代的作用。崔波等[18]研究發(fā)現，SOC1基因在蝴蝶蘭不同時期不同部位的表達量不同，根中SOC1基因表達量在營養(yǎng)生長期達到最高，葉中則是抽葶期的表達水平最高，而在子房發(fā)育期只有微量表達，但在盛花期、抽葶期、子房發(fā)育期的花葶中表達量均達到較高水平，表明SOC1基因不但調控蝴蝶蘭的營養(yǎng)生長，也參與調控生殖生長，包括促進開花和影響蕊柱和子房的發(fā)育，但對花器官外輪的形成幾乎無影響。李思誼[19]從姬蝴蝶蘭（Phal.equestris）中分離到1個SOC1同源基因PeSOC1并對其表達量進行研究，發(fā)現該基因在植株開花后2周葉片中的表達最強，花中最微弱;將此基因轉入野生型擬南芥與SOC1、FT突變株后發(fā)現T1、T2子代均能提早開花，推測PeSOC1基因能夠正向調控開花時間。

1.3 LFY基因

LFY是花分生組織基因，廣泛表達于營養(yǎng)器官與生殖器官，并與調控開花時間的基因密切相關。它是整合環(huán)境信號與內源信號的開花控制因子，能夠啟動植物開花過程，并且控制花的生長發(fā)育?，F已在蝴蝶蘭中鑒別出LFY的同源基因，如Zhang等[20]從蝴蝶蘭中克隆出LFY的同源基因PhapLFY，其在營養(yǎng)器官與生殖器官中均有表達，且在營養(yǎng)生長向生殖生長轉換時，莖中的表達量呈逐漸升高趨勢，尤其在花發(fā)育過程中，花序分生組織、花分生組織和花原基中均有較強表達，說明PhapLFY基因可能參與蝴蝶蘭生殖發(fā)育的調控;白蝴蝶蘭中LFY的同源基因PhapLFY則主要在花原基和處于發(fā)育時期的花序中表達，可以緩解擬南芥lfy突變體的花器官畸形[21]。

2 蝴蝶蘭花器官發(fā)育相關基因的研究進展

花發(fā)育的ABC模型在1990年被提出，隨后科學家又發(fā)現了D類基因[22]和E類基因[23]，并衍生出“ABCDE”模型，即花發(fā)育是由A、B、C、D、E同源異型基因所調控。其中每個字母表示一類功能，A+E控制花萼發(fā)育，A+B+E控制花瓣發(fā)育，B+C+E控制雄蕊發(fā)育，C+E控制心皮發(fā)育，D+E控制胚珠發(fā)育[24，25]。

2.1 A類基因

蝴蝶蘭A類基因的研究相對較少.主要包括FUL-like和AP1基因。袁秀云等[26]從朵麗蝶蘭中克隆出1個A類基因AP1，發(fā)現其主要在根和葉中表達，在花器官中痕量表達，推測其可能參與調控植株開花進程，而不參與花器官的形態(tài)建成。研究發(fā)現，AP1基因在蝴蝶蘭營養(yǎng)器官與生殖器官中均有表達，且在盛花期花葶中表達量最高，推測其與調控開花有密切關系[27]。另外，Chang等[28]證實FUL-like基因ORAP11和ORAP13在蝴蝶蘭營養(yǎng)器官和生殖器官均有表達，ORAP11僅在蕊柱中有表達，而ORAP13在花器官中均不表達，但二者在植株的成花轉變及形態(tài)構建過程中均起到重要作用。

2.2 B類基因

B類基因具有調控第2、3輪花器官（花瓣和雄蕊）發(fā)育的功能，以PI和AP3為代表，它們相互結合發(fā)生作用，并存在自動調控機制?，F已在蝴蝶蘭中分離到多個B類基因的同源基因。

Tsai等[29]對從小蘭嶼蝴蝶蘭中分離出的4個DEF-like基因PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5進行分析，得到PeMADS基因的作用貫穿于整個花發(fā)育過程，但表達方式存在較大差異;PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5基因在野生型蝴蝶蘭的整個花器官中均有表達，其中PeMADS2基因在花萼、花瓣中表達量最高，在蕊柱中弱表達，在唇瓣中不表達，證明其與花被片發(fā)育密切相關;PeMADS3基因在花瓣、唇瓣、蕊柱中表達，而在花萼和花粉中無表達，證明其與花瓣發(fā)育密切相關;PeMADS4基因僅在唇瓣、蕊柱中高表達，表明其與唇瓣發(fā)育有關;PeMADS5基因在花瓣中高表達，而在萼片、唇瓣、蕊柱中僅微量表達，表明其與側瓣發(fā)育有關。此外還分離到1個GLO/PI-like基因PeMADS6，其在除花粉塊外的花器官中均有表達，在花衰老進程中，花中PeMADS6基因的表達量降低，但只有在由授粉誘導的花衰老過程中，子房中PeMADS6基因的表達量才會減弱，可見授粉會調控該基因在子房中抑制表達。

Guo等[30]從蝴蝶蘭中克隆得到3個PI-like基因PhPI9、PhPI10、PhPI15和1個PhAP3基因，研究結果表明3個PI-like基因均在生殖發(fā)育階段表達，在營養(yǎng)生長階段不表達;PhPI9、PhPI10僅在唇瓣中表達，PhPI15與PhAP3在所有花器官中均有表達，PhAP3在藥帽處高表達，且與雄性不育相關。張浩等[31，32]通過對蝴蝶蘭PhAP3基因的研究發(fā)現，其在營養(yǎng)器官和花器官中均有表達，在花芽、萼片、捧瓣中高表達，在根和葉中微量表達，證實PhAP3在花發(fā)育過程中起重要作用，且與蝴蝶蘭的萼片花瓣化有關。

袁秀云等[33]從蝴蝶蘭花瓣中克隆了一個B類BGLO/PI轉錄因子PhalPI，分析結果表明PhalPI基因僅在生殖器官中表達，且在授粉后的子房中表達量降低，這與PeMADS6基因表達模式相同;PhalPI基因的表達量在萼片唇瓣化突變體的萼片和蕊柱中顯著升高，在雄蕊花瓣化突變體的萼片和側瓣中降低，在唇瓣和蕊柱中的表達水平顯著升高，在側瓣合柱化突變體的蕊柱中也顯著升高，但在側瓣唇瓣化和側瓣花藥化突變體中的表達水平無明顯變化。由此可見，PhalPI基因與花器官形態(tài)突變密切相關，而與側瓣唇瓣化和側瓣花藥化突變無關。

2.3 C類和D類基因

C、D類基因具有較高的同源性，與植物生殖發(fā)育密切相關。擬南芥中C類功能基因主要有AG，主要參與調控雄蕊與雌蕊發(fā)育;D類基因主要有STK、SHP1和SHP2，主要調控胚珠發(fā)育。

Song等[34]在蝴蝶蘭中分離鑒定出2個AG-like基因PhalAG1和PhalAG2，分別屬于C類和D類基因，兩基因具有相似的表達模式，在唇瓣、蕊柱和胚珠中均表達，且僅在花芽中表達，在營養(yǎng)器官中均無表達。陳佑亦[35]從姬蝴蝶蘭中分離鑒定出1個C類基因PeMADS1和1個D類基因PeMADS7，發(fā)現它們在合蕊柱和胚珠發(fā)育均起到重要作用且具有一定的協同作用。

袁秀云等[36，37]從蝴蝶蘭中克隆到2個C類MADS-box基因PhAG1a和PhAG1b，研究表明PhAG1a基因與PhalAG1、PeMADS7基因關系相近，且只在植物蕊柱和子房中表達，在營養(yǎng)器官中不表達。在5類花器官突變體中，PhAG1a基因在3類花器官突變體（退化雄蕊變異為側瓣、蕊柱合生和側萼片變異為唇瓣與側瓣退化）中的表達沒有變化，但在2類花器官突變體（側瓣變異為唇瓣和側瓣頂端長出花藥）蕊柱中的表達水平明顯降低，因而推測其在調控蝴蝶蘭合蕊柱發(fā)育中起重要作用。PhAG1b基因只在蕊柱和子房中表達，在營養(yǎng)器官與花器官的萼片、側瓣和唇瓣中均不表達，在授粉后的子房中和2類花器官突變體（側萼和側瓣變異為唇瓣）蕊柱中的表達水平明顯降低，在退化雄蕊變異為花瓣的花器官突變體中表達沒有明顯變化，而在另2類花器官突變體（側瓣退化與蕊柱合生、側瓣頂端長出花藥）蕊柱中的表達顯著升高。表明PhAG1b基因主要參與調控花器官中蕊柱和子房發(fā)育，其功能或與B類基因的功能互為消長。

2.4 E類基因

E類基因與AP1/FUL基因相同，只存在于被子植物中，主要包括SEP1、SEP2、SEP3、SEP4等基因。SEP基因和A類、B類、C類基因同時表達，能夠使營養(yǎng)葉轉變?yōu)榛ㄆ鞴賉38]。鄭至勤[39]從姬蝴蝶蘭中克隆到2個E類基因PeMADS8、PeMADS9，證實它們在唇瓣中特異表達，與B類基因PeMADS4相似，推測其可能與唇瓣發(fā)育有關。同時也從姬蝴蝶蘭的EST庫中篩選到PeEREBP1、PeEREBP2、PebHLHL1，均與PeMADS4的表達特性相似，可能也與唇瓣發(fā)育相關。

Pan等[40]證實從小蘭嶼蝴蝶蘭分離到的PeSEP1、PeSEP2、PeSEP3、PeSEP4基因均與蝴蝶蘭花器官的形成有關。羅云汝[41]認為AGL6-like基因在營養(yǎng)和生殖器官中均有表達，能促進植株開花。

3 其它相關基因的研究進展

CONSTANS（CO）是光周期調控途徑中的關鍵基因之一，作為光周期下游基因可以將光信號轉換為開花信號傳遞給FT基因，從而促進植物開花[42，43]。Zhang等[20]通過研究蝴蝶蘭中分離的CO-like基因PhalCOL發(fā)現，它在所有器官中均有表達，且在營養(yǎng)生長向生殖生長轉換過程中莖中的表達量較高，而過度表達會導致早花，同時還發(fā)現花芽發(fā)育會影響PhalCOL基因的表達。由此可推測PhalCOL基因與蝴蝶蘭花芽誘導密切相關。

EFL4基因屬于光周期途徑調控植物成花的基因，在植物成花中起著關鍵作用。DhEFL2、DhEFL3、DhEFL4基因是朵麗蝶蘭光周期途徑上游基因EFL4的同源基因，Chen等[44，45]研究發(fā)現其在營養(yǎng)器官與生殖器官中均有表達，且在花芽形成初期表達量最高;在長日照條件下，DhEFL2、DhEFL3、DhEFL4基因的日表達規(guī)律較為相似，而在短日照條件下，基因DhEFL3的表達規(guī)律與DhEFL2、DhEFL4存在一定差異;在擬南芥中3個基因超量表達均會出現晚花現象。

Zhang等[46，47]分離出兩個與植物自主途徑調控開花的關鍵基因DhPRP39、DhFVE，發(fā)現其參與蝴蝶蘭的成花誘導過程，推測其在花序啟動過程中發(fā)揮著重要作用。同時還發(fā)現過量表達的DhPRP39和DhFVE基因均會不同程度地延遲擬南芥開花。

Bui等[48]發(fā)現3種ACC合成酶基因在蝴蝶蘭受粉后的子房發(fā)育過程中起著重要作用，生長素、乙烯均可誘導該基因與ACC氧化酶的mRNA在花器官中積累，而去雄蕊后則無法誘導其在花器官中表達。

4 前景與展望

蝴蝶蘭成花過程的分子生物學研究已取得很大進展，但目前的研究大多是針對單一因素進行，很少有綜合多種因素的研究，因此，綜合多種因素對蝴蝶蘭成花分子機制進行研究并探索不同類型成花基因的互作關系，是未來蝴蝶蘭分子生物學研究的重要方向。同時，目前國內外對蝴蝶蘭基因的研究主要集中在花啟動、花發(fā)育等方面，對花色和香氣基因的研究報道較少，花色、香氣是蝴蝶蘭等蘭科植物的重要品質因素，因此對花色素苷合成中的調控因子和相關香味基因的研究應加強。

深入研究蝴蝶蘭成花過程中的相關基因，將有利于通過基因工程改善蝴蝶蘭花品質及更好地進行花期調控，同時為我們利用基因改造花部性狀、改變花的育性提供可能。這對推動蝴蝶蘭分子育種進程具有重要意義，同時可結合溫度、光照、濕度等環(huán)境因素為蝴蝶蘭產業(yè)提供新的理論依據。

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