MRTF-A通過HOTAIR調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的增殖及遷移

張琨 周渝斌 馮剛 曾富春

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要類型之一，占肺癌的80%-85%，在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率以及死亡率[1,2]。由于早期不具備明顯的臨床癥狀，患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)錯過最佳治療時(shí)期，致使其5年生存率不足15%[3,4]。盡管諸多治療手段不斷推廣應(yīng)用，但由于NSCLC的遷移以及侵襲特性，患者長期生存率及生存狀況不盡人意[5,6]。

MRTF-A是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SRF的輔助因子。Rho信號通路中MRTF-A與G-actin結(jié)合阻滯了其核運(yùn)輸，抑制了靶基因的激活。MRTF-A通過與SRF形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體，結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域調(diào)控基因的表達(dá)[7-9]。有文獻(xiàn)[10,11]報(bào)道，在乳腺癌中MRTF-A能夠調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)（MMP3及MMP9）進(jìn)而調(diào)控乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移。

LncRNA是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類長度超過200 nt非編碼RNA，在真核細(xì)胞內(nèi)普遍表達(dá)但是不編碼蛋白質(zhì)[12]。大量研究證明，lncRNA能夠通過與蛋白質(zhì)、DNA或RNA相互作用，在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移以及侵襲等生物學(xué)進(jìn)程[13,14]。HOTAIR是2007年發(fā)現(xiàn)的一個LncRNA，在多種腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá)，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展遷移以及侵襲密切相關(guān)[15,16]。因此，準(zhǔn)確揭示MRTF-A與HOTAIR在NSCLC發(fā)生發(fā)展以及遷移侵襲中的作用具有重要的臨床意義。本文擬通過實(shí)驗(yàn)研究MRTF-A及HOTAIR對NSCLC增殖遷移的影響以及MRTF-A對HOTAIR表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司。HOTAIR的siRNA購于中國廣州銳博生物科技有限公司。MRTF-A抗體購Abcam公司。Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)購于美國LICOR公司。CCK8購于Sigma公司。Trizol、SYBR及Lipo2000購于美國Invitrogen公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自加拿大Fermentas公司。肺癌細(xì)胞株A549由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%FBS的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液含青霉素/鏈霉素100 U/mL，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期A549 肺癌細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染前24 h接種至6孔板（3×105個/孔）繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合度達(dá)70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染依照Lipo2000說明書，將質(zhì)粒（siRNA）轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中，在37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol法提取NSCLC細(xì)胞A549/DDP的總RNA，利用RevertAid First逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，分別以MRTF-A、GAPDH及HOTAIR引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。MRTF-A上游引物：5'-ACCGTGACCAATAAGAATGC-3'，下游引物：5'-CCGCTCTGAATGAGAATGTC-3'。HOTAIR上游引物：5'-TAGGCAAATGTCAGAGGGTT-3'，下游引物：5'-ACACAAGTAGCAGGGAAAGG-3'。GAPDH引物，上游引物：5'-CGAG ATCCCTCCAAAATCAA-3'，下游引物：5'-TTCACACCCATG AC GAACAT-3'。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液RIPA裂解提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒流300 mA轉(zhuǎn)移至PVDF印跡膜。5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日PBS洗膜，二抗室溫孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光法顯色，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)。

1.6 CCK8檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以0.3×105個/mL接種于96孔板中100 μL/孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。Lipo2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（siRNA）48 h，將舊培養(yǎng)基吸去，置換含10%CCK-8的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)3 h，測450 nm吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的增殖率。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，分別將300 μL細(xì)胞懸液和700 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640加入每Transwell上室和下室，并于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h；取出Transwell小室，吸棄液體，醫(yī)用棉簽擦凈內(nèi)部基底膜；PBS漂洗，4%低聚甲醛固定10 min；結(jié)晶紫染液染色20 min；清水漂洗，顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0（SPSS,Chicago, USA）軟件處理，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性比較采用t檢驗(yàn)，單因素ANOVA分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本文中每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)n≥3。

2 結(jié)果

圖 1 過表達(dá)MRTF-A促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖及遷移。A：過表達(dá)MRTF-A后的qRT-PCR驗(yàn)證；B：過表達(dá)MRTF-A后的Western blot驗(yàn)證；C：CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖；D：transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移；E：過表達(dá)細(xì)胞與對照細(xì)胞遷移率的柱形圖比較（**P＜0.01）；F ：干擾MRTF-A后的qRT-PCR驗(yàn)證；G：干擾MRTF-A后的Western blot驗(yàn)證；H：CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖；I：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移；J：干擾細(xì)胞與對照細(xì)胞遷移率的柱形圖比較（**P＜0.01）。Fig 1 Overexpression of MRTF-A promotes proliferation and migration ofA549 cells.A： qRT-PCR verification after overexpression of MRTF-A； B： Western blot verification after overexpression of MRTF-A； C： CCK8 assay for detection of cell proliferation； D： transwell assay for cell migration； E： bar graph of overexpressing cells versus control cell mobility (**P＜0.01)； F： qRT-PCR validation after MRTF-A interference； G： Western blot validation after MRTF-A interference； H： CCK8 assay for cell proliferation； I： Transwell assay for cell migration； J： bar graph of interference cells versus control cell mobility (**P＜0.01).

2.1 MRTF-A促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖及遷移 在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A的過表達(dá)質(zhì)粒之后，MRTF-A的表達(dá)量顯著增高，是對照組的18倍（圖1A、圖1B）。通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖率變化，通過Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測對A549細(xì)胞遷移影響，結(jié)果如圖1所示。該結(jié)果表明過表達(dá)MRTF-A顯著促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖。在72 h時(shí)，過表達(dá)MRTF-A細(xì)胞增殖是對照組的1.5倍（圖1C）。與對照組相比過表達(dá)MRTF-A之后，A549細(xì)胞的遷移能力加強(qiáng)，細(xì)胞遷移率是對照組的3.5倍（圖1D、圖1E）。為進(jìn)一步驗(yàn)證MRTF-A能夠調(diào)控A549細(xì)胞的增殖及遷移，我們在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A的干擾質(zhì)粒如圖1F所示，與對照組相比轉(zhuǎn)染shMRTF-A質(zhì)粒之后，MRTF-A的表達(dá)量下調(diào)55%。同樣的結(jié)果在蛋白水平得到驗(yàn)證（圖1G）。轉(zhuǎn)染shMRTF-A之后，在72h檢測A549細(xì)胞的增殖率是對照組的60%（圖1H）。通過遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染shMRTF-A質(zhì)粒之后，A549細(xì)胞的遷移率是對照組的55%（圖1I、圖1J）。由此可以得出MRTF-A能夠調(diào)控A549細(xì)胞的增殖及遷移的結(jié)論。

2.2 沉默HOTAIR的表達(dá)抑制A549細(xì)胞的增殖及遷移為驗(yàn)證LncRNA HOTAIR對A549細(xì)胞增殖及遷移的影響，我們設(shè)計(jì)合成了HOTAIR的siRNA，將siRNA的陰性對照（NC-siRNA）及siRNA-HOTAIR轉(zhuǎn)染進(jìn)入A549細(xì)胞，通過qRT-PCR檢測HOTAIR的干擾效率（圖2A）。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-HOTAIR之后細(xì)胞增殖速度顯著下降。對照組在72 h時(shí)增殖率是實(shí)驗(yàn)組的1.8倍（圖2B）。沉默HOTAIR表達(dá)，A549細(xì)胞的遷移率降低。與對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-HOTAIR的實(shí)驗(yàn)組遷移率是對照組的1/5（圖2C、圖2D）。由此可以得出HOTAIR能夠調(diào)控A549細(xì)胞增殖及遷移的結(jié)論。

2.3 MRTF-A調(diào)控HOTAIR的表達(dá) 為驗(yàn)證MRTF-A是否能夠調(diào)控HOTAIR的表達(dá)，我們在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A的過表達(dá)質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒檢測HOTAIR的表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖3所示。在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A的過表達(dá)質(zhì)粒，MRTF-A的表達(dá)量是對照組的13倍。與對照組相比，HOTAIR的表達(dá)量顯著上升是對照組的2.7倍（圖3A）。A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A的干擾質(zhì)粒，MRTF-A的表達(dá)量顯著下降是對照組的50%。與對照組相比，轉(zhuǎn)染shMRTF-A之后HOTAIR的表達(dá)量明顯下降是對照組的60%（圖3B）。由此可以得出MRTF-A調(diào)控HOTAIR表達(dá)的結(jié)論。

圖 2 沉默HOTAIR抑制A549細(xì)胞的增殖及遷移。A：沉默HOTAIR后的qRT-PCR驗(yàn)證；B：CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖；C：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移；D：沉默HOTAIR組與對照組細(xì)胞遷移率的柱形圖比較（**P＜0.01）。Fig 2 Silent HOTAIR expression inhibited proliferation and migration of A549 cells.A： qRT-PCR validation after HOTAIR silent； B： CCK8 assay for cell proliferation； C： Transwell assay for cell migration； D： bar graph of silent cells versus control cell mobility (**P＜0.01).

2.4 MRTF-A調(diào)控HOTAIR啟動子活性的變化 為進(jìn)一步驗(yàn)證MRTF-A對HOTAIR的調(diào)控作用，查閱MRTF-A相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)MRTF-A能夠與CArG-box序列特異性結(jié)合。通過UCSC網(wǎng)站在HOTAIR啟動子上游680 bp位置找到一個CArG-box序列類似序列，構(gòu)建了HOTAIR的啟動子。在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A的過表達(dá)質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒檢測對HOTAIR啟動子活性的影響，結(jié)果如圖4所示。A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A的過表達(dá)質(zhì)粒及HOTAIR啟動子質(zhì)粒48 h之后，與對照組相比HOTAIR的啟動子活性上調(diào)5倍（圖4A）。與之相反，在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A的干擾質(zhì)粒及HOTAIR的啟動子質(zhì)粒之后，HOTAIR啟動子活性下降45%（圖4B）。由此可以得出MRTF-A能夠調(diào)控HOTAIR啟動子活性的結(jié)論。

2.5 沉默HOTAIR的表達(dá)可以rescue過表達(dá)MRTF-A對A549增殖和遷移的促進(jìn)作用 為驗(yàn)證MRIF-A對肺癌細(xì)胞A549的增殖和遷移的促進(jìn)作用是否與調(diào)控HOTAIR有關(guān)，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MRIF-A和HOTAIR的siRNA，通過qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MRIF-A后MRIF-A的表達(dá)量明顯增高且HOTAIR的表達(dá)量也增高，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MRIF-A和HOTAIR的siRNA后，HOTAIR的表達(dá)量有所下降，說明轉(zhuǎn)染成功（圖5A）。應(yīng)用CCK8及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測共轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞增殖和遷移的影響，結(jié)果表明過表達(dá)pcDNA3.1-MRIF-A促進(jìn)細(xì)胞增殖，但是共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MRIF-A和HOTAIR的siRNA后細(xì)胞增殖減慢（圖5B）。Transwell的結(jié)果表明共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MRIF-A和HOTAIR的siRNA后，細(xì)胞的遷移率較過表達(dá)MRIF-A組減慢（圖5C、圖5D）。結(jié)果說明了共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MRIF-A和HOTAIR的siRNA可以rescue過表達(dá)MRTF-A對A549增殖和遷移的促進(jìn)作用。

3 討論

肺癌作為一種高死亡率的腫瘤，究其發(fā)病的原因涉及到多個方面。原癌基因的激活、抑癌基因失活、基因突變、DNA甲基化以及非編碼RNA的異常表達(dá)等原因均會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而肺癌5年生存率偏低與腫瘤的遷移密切相關(guān)[17-19]。因此準(zhǔn)確揭示肺癌的發(fā)生發(fā)展及遷移的機(jī)制對于肺癌的診斷以及治療具有重要的指導(dǎo)意義。

圖 3 MRTF-A調(diào)控HOTAIR的表達(dá)。A：qRT-PCR檢測過表達(dá)MRTF-A后HOTAIR的mRNA水平變化；B：qRT-PCR檢測干擾MRTF-A后HOTAIR的mRNA水平變化。Fig 3 MRTF-A regulates HOTAIR expression.A： qRT-PCR detects changes in HOTAIR mRNA levels after overexpression of MRTF-A； B： qRT-PCR detects changes in HOTAIR mRNA levels after interference with MRTF-A.

圖 4 MRTF-A調(diào)控HOTAIR啟動子活性。A：過表達(dá)MRTF-A后HOTAIR啟動子活性的比較（**P＜0.01）；B： 干擾MRTF-A后HOTAIR啟動子活性的比較（**P＜0.01）。Fig 4 MRTF-A regulates HOTAIR promoter activity.A： Comparison of HOTAIR promoter activity after overexpression of MRTF-A (**P＜0.01)； B：Comparison of HOTAIR promoter activity after interference with MRTF-A (**P＜0.01).

圖 5 共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MRIF-A和HOTAIR的siRNA對細(xì)胞增殖和遷移的影響。A：qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果（**P＜0.01, *P＜0.05）；B：CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖；C：transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移；D：三組細(xì)胞遷移率的比較（**P＜0.01）。Fig 5 Effect of co-transfected with pcDNA3.1-MRIF-A and siRNAs- HOTAIR on cell proliferation and migration.A： qRT-PCR verified transfection efficiency (**P＜0.01, *P＜0.05)； B： CCK8 assay for cell proliferation； C： transwell assay for cell migration； D： comparison of three groups of cell migration (** P＜0.01).

Rho信號通路中，RhoC及其激酶ROCK通過調(diào)控細(xì)胞骨架組建參與腫瘤的遷移進(jìn)程。在調(diào)控細(xì)胞骨架構(gòu)建過程中，Rho效應(yīng)激酶通過G-actin影響MRTFs（MRTF-A/MRTF-B）的出入核控制其與靶基因的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[20-22]。MRTF-A作為血清反應(yīng)因子SRF的輔助因子通過與SRF形成MRTF-A-SRF轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的CArG-box序列上調(diào)控基因的表達(dá)[23,24]。在乳腺癌腫瘤MDAMB-231細(xì)胞中，Rho-actin-MRTF-A-SRF信號通路能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[25]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道MRTF-A通過調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞生長、分化、遷移及肌生成過程中發(fā)揮重要作用[26]。本研究數(shù)據(jù)表明，在NSCLC中MRTF-A能夠調(diào)控A549細(xì)胞的增殖及遷移。

HOX反義基因（HOTAIR）是近年發(fā)現(xiàn)的一個長鏈非編碼RNA，通過調(diào)控基因表達(dá)及染色質(zhì)動力學(xué)在各種癌癥中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR通過組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶PRC2及組蛋白去甲基化酶LSD1沉默基因的表達(dá)[13,15,27]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HOTAIR在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、食管鱗狀癌及惡性膠質(zhì)瘤中均存在異常表達(dá)，并在這些腫瘤的增殖及遷移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[28]。HOTAIR能夠通過調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、腫瘤的增殖、EMT進(jìn)程、腫瘤的遷移及侵襲進(jìn)程[29]。我們的研究表明，HOTAIR能夠調(diào)控NSCLC A549細(xì)胞的增殖及遷移的進(jìn)程。

綜上，本研究通過在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A及shMRTF-A質(zhì)粒證實(shí)MRTF-A調(diào)控A549細(xì)胞增殖及遷移的結(jié)論。通過沉默A549細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)，證明HOTAIR在A549細(xì)胞增殖及遷移的過程中發(fā)揮重要作用。A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MRTF-A及shMRTF-A質(zhì)粒得出MRTF-A影響HOTAIR表達(dá)及其啟動子活性的結(jié)果。由此推測，MRTF-A-SRF-HOTAIR信號通路在NSCLC增殖及遷移的過程中可能發(fā)揮著重要的作用，其具體的分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究，能否將HOTAIR作為NSCLC診斷及治療的靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步探索。