和田密植紅棗果實發(fā)育中高維生素C積累與相關(guān)酶活性及獨特環(huán)境協(xié)同作用的關(guān)系

摘要：對4個和田紅棗品種果實發(fā)育過程中維生素C含量和半乳糖內(nèi)酯脫氫酶、抗壞血酸氧化酶、抗壞血酸過氧化物酶、單脫氫抗壞血酸還原酶、脫氫抗壞血酸還原酶的活性以及果實鮮干質(zhì)量和糖積累進行測試分析，結(jié)果顯示，維生素C含量的積累在發(fā)育過程中呈“S”形的模式，其中120、140 d是維生素C積累最快和最重要的2個時期。半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性與維生素C積累速率及糖的變化趨勢相似，二者在60～120 d呈明顯的線性正相關(guān)關(guān)系。維生素C分解酶抗壞血酸氧化酶和抗壞血酸過氧化物酶只在發(fā)育前期短時間內(nèi)表現(xiàn)活性，從而使維生素C極少被氧化分解，這是棗果實能積累高水平維生素C的重要原因;單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶的活性則主要表現(xiàn)在生育后期，結(jié)果顯示，3個制干棗品種中維生素C含量主要受半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性調(diào)節(jié)，同時維生素C代謝酶抗壞血酸氧化酶也對維生素C積累起到了重要作用，而單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶活性對維生素C積累的作用主要在生長晚期，制干品種生育期比鮮食品種延長55～65 d，果實成熟采收期比其他區(qū)域延遲30～45 d，此時制干棗品種果實維生素C積累明顯高于鮮食棗品種。

關(guān)鍵詞：棗品種;抗壞血酸;半乳糖內(nèi)酯脫氫酶;抗壞血酸氧化酶;抗壞血酸過氧化物酶

中圖分類號： S665.101? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0090-05

收稿日期：2017-11-06

基金項目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團產(chǎn)學(xué)研重大專項（編號：2010ZX02）;科技部富民強縣專項（編號：2011KJ008）。

作者簡介：徐勝利（1964—），男，上海人，博士，教授，研究方向為園林資源與利用研究。E-mail：xusl0997@163.com。

維生素C是植物體內(nèi)合成的一類己糖內(nèi)酯化合物，不僅是維持人體健康的必需物質(zhì)，而且對植物在維持細胞光合和代謝的氧化還原平衡方面具有特殊功能[1]。它廣泛存在于各類新鮮果和干果中，是人體必需的維生素之一，且由于人類缺乏其合成關(guān)鍵酶而只能從食物中獲取，因此，維生素C含量已成為衡量果品品質(zhì)的重要指標(biāo)，果品維生素C的合成途徑和代謝機理等方面的研究在刺梨、白菜、獼猴桃等中已有報道[2-4]，而有關(guān)和田紅棗維生素C積累與相關(guān)酶活性方面鮮見報道。

植物體內(nèi)維生素C含量受合成和再生能力的調(diào)控。維生素C-谷胱甘肽循環(huán)是維生素C再生的主要途徑。在該途徑中，抗壞血酸過氧化物酶以維生素C為電子供體清除H2O2的同時，將維生素C氧化成單脫氫抗壞血酸，單脫氫抗壞血酸一部分可在單脫氫抗壞血酸還原酶的催化下還原為維生素C，一部分可通過非酶歧化反應(yīng)生成維生素C和脫氫抗壞血酸，而脫氫抗壞血酸在脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽參與下可被還原為維生素C。若脫氫抗壞血酸不能及時被還原，進一步會被氧化降解為草酸和酒石酸而被丟失[5]。

和田具有獨特的小氣候、光熱和立地栽培條件，其出產(chǎn)的制干紅棗品質(zhì)在我國干棗中一枝獨秀，成為特色區(qū)域性干棗中的極品，近年來和田制干紅棗發(fā)展迅猛，暢銷全國及東南亞，和田已發(fā)展成為我國最優(yōu)制干棗生產(chǎn)基地[6]。紅棗果實具有豐富的營養(yǎng)價值，尤以其高維生素C含量而被譽為“維C之王”，但迄今對和田密植紅棗果實維生素C積累機制研究尚未見報道。對于研究維生素C的合成代謝機制而言，紅棗因其童期很短、邊花芽分化邊開花邊結(jié)果，維生素C含量極高而成為理想的果樹維生素C代謝機制研究材料。本研究中以和田主栽制干品種駿棗、金昌一號、灰棗和鮮食品種冬棗果實為試材，研究密植紅棗不同生長發(fā)育時期維生素C含量及代謝相關(guān)酶活性的變化，探討在果實生長發(fā)育過程中它們與維生素C積累的關(guān)系，為揭示和田密植紅棗果實高維生素C內(nèi)外協(xié)同關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅棗材料為5年生制干品種駿棗、金昌一號、灰棗和鮮食品種冬棗，于2010年建園直播酸棗種植于和田農(nóng)十四師224團，2011年同時嫁接上述品種，每個品種按照標(biāo)準(zhǔn)化種植面積46 690 m2，行株距為0.5 m×0.7 m×1.5 m的寬窄行模式，株高1.3 m，南北行向，個體樹形為超矮3～4短枝籬壁樹形，樹勢和大小一致。在花期，選取15棵長勢基本一致的植株，與生產(chǎn)同花期（6月初）噴灑GA3 1～2次，使每棵樹的坐果量基本一致，于2011年3月嫁接（花后20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 d），每個品種隨機采取果實100 g，取部分用于直接測定鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，剩余樣品用液氮處理并保存于-70 ℃待用。取未去皮的果肉測定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2 紅棗果實鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的測定

每次分別于花后10個時期4個紅棗品種隨機取30個果實直接稱量鮮質(zhì)量并計算平均單果質(zhì)量;之后立刻于115 ℃殺酶20～30 min，并于65 ℃下烘干至恒質(zhì)量，計算平均單果干物質(zhì)質(zhì)量，重復(fù)3次。

1.3 水溶性總糖、還原糖及蔗糖含量的測定

測定時對花后10個時期4個紅棗品種各稱取約4 g紅棗果肉，水溶性總糖、還原糖及蔗糖含量按林炎坤的方法[7]測定。

1.4 維生素C和脫氫抗壞血酸含量的測定

分別于花后10個時期，4個紅棗品種各稱取5 g棗，取其果肉在5 ℃下于5%偏磷酸中研磨成勻漿以防止維生素C的氧化和脫氫抗壞血酸的降解，然后在5 ℃、1 910 r/min離心20 min，收集上清液用于測定維生素C和脫氫抗壞血酸含量。測定時，反應(yīng)體系中分別加入濃度為1.25 U/mL的抗壞血酸氧化酶和2 mmol/L的二硫蘇糖醇用于氧化維生素C和還原脫氫抗壞血酸，用紫外分光光度計測定其在265 nm的吸光度變化。用已知濃度的維生素C和脫氫抗壞血酸溶液以相同的方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偩S生素C含量=維生素C含量+脫氫抗壞血酸含量[8-9]。

1.5 半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性測定

分別于花后10個時期每個紅棗品種稱取4 g紅棗果肉在5 mL含400 mmol/L蔗糖的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH值7.4）中研磨成勻漿，然后2層紗布過濾;濾液在26 r/min下離心10 min，收集上清;于477 r/min離心20 min后收集沉淀。將沉淀輕輕懸浮于0.5 mL含400 mmol/L蔗糖的 100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH值7.4）中，供酶活性測定使用。以上操作均在4 ℃下進行。半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性測定：2.4 mL反應(yīng)體系中含有2 mL 1.05 mg/mL的細胞色素C、200 μL 56 mmol/L的L-半乳糖內(nèi)酯和200 μL提取液。測定前先將反應(yīng)混合液于25 ℃預(yù)溫育1 min，反應(yīng)從加入L-半乳糖內(nèi)酯后開始計時。摩爾系數(shù)值17.3 L/（mmol·cm）用于酶活性計算，酶活性單位定義：L-半乳糖內(nèi)酯氧化量為 1 nmol/min （相當(dāng)于細胞色素C還原量為2 nmol/min）為1單位半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性[10]。其中細胞色素C和L-半乳糖內(nèi)酯均購自Sigma公司。

1.6 抗壞血酸氧化酶、丙氨酸氨肽酶以及單脫氫抗壞血酸還原酶、脫氫抗壞血酸還原酶活性測定

分別于花后10時期每個紅棗品種稱取1～2 g紅棗果肉，在含甘露糖（0.3 mol/L）、乙二胺四乙酸（1 mmol/L）、牛血清白蛋白（0.1%）、半胱氨酸（0.05%）及聚乙烯吡咯烷酮（2%）的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（50 mmol/L，pH值7.2）中于4 ℃下研磨成勻漿，1 910 r/min離心20 min，收集上清液用分光光度計法測定這4種酶活性。酶活性定義：維生素C氧化量為1 μmol/min為1單位（U）抗壞血酸氧化酶或丙氨酸氨肽酶活性;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化量為 1 μmol/min 為1單位（U）單脫氫抗壞血酸還原酶活性;脫氫抗壞血酸還原量為1 μmol/min為1單位（U）脫氫抗壞血酸還原酶活性[11]。脫氫抗壞血酸的含量為總維生素C與維生素C間的差值，用維生素C/脫氫抗壞血酸比值來表示維生素C的氧化還原狀態(tài)。以上指標(biāo)均重復(fù)3次。測試數(shù)據(jù)采用SAS 9.4軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制干棗和鮮食棗果實鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的變化

由圖1可知，制干棗品種果實鮮質(zhì)量和干質(zhì)量在花后 40～160 d持續(xù)快速增加，其中60～160 d增加幅度較大，于160 d達到峰值，鮮質(zhì)量160 d后開始有所下降而灰棗質(zhì)量有所增加;制干棗品種完熟采收期比鮮食冬棗延遲45 d，而在花后120 d，這使制干棗果實密度增加從而有利于制干棗品質(zhì)的形成，顯示制干棗飽滿且肉厚;采收期制干棗干質(zhì)量和鮮質(zhì)量略有下降，是由于失水后呈半干狀態(tài)，此時80%以上的果實仍然掛在樹上。鮮食冬棗從幼果發(fā)育到果實成熟的整個過程持續(xù)105 d時間。

2.2 制干棗和鮮食棗果實發(fā)育過程中維生素C水平及其積累量的變化

制干棗品種和鮮食冬棗維生素C含量在果實快速生長期（60 d后）快速提高， 在花后120 d達到最大， 是花后40 d

的6.32倍;花后120～140 d開始明顯下降，花后 160 d 下降趨緩，僅下降17.8%;自花后40 d開始鮮食冬棗維生素C含量一直明顯高于制干棗品種，直至140 d采收，制干棗品種間差異明顯，駿棗維生素C含量﹥金昌一號維生素C含量﹥灰棗維生素C含量（圖2）。

從整個紅棗果實維生素C積累量來看，維生素C的積累主要在花后40 d之后，花后140 d才達到峰值，為花后20 d的74.52倍。160 d后維生素C的形成和降解達到相對平衡，積累量基本穩(wěn)定。

2.3 制干棗和鮮食棗果實發(fā)育過程中維生素C和脫氫抗壞血酸含量的變化

由圖3可見，在鮮食棗果實的整個發(fā)育過程中，冬棗果實

維生素C的積累速率總體上呈“快-快-快”直線形的快速上升趨勢，采收前達到最高水平，并明顯高于制干棗;鮮食棗冬棗脫氫抗壞血酸的積累速率總體上呈“降→升→降→升”的“W”形變化趨勢，并明顯高于制干棗。制干棗維生素C于花后40 d開始積累，至花后140 d達到峰值，在此后的自然失水干燥中略有下降，制干棗間差異不明顯;制干棗品種脫氫抗壞血酸含量積累速率也呈“W”形變化，但在140 d后，有一個長達60 d的緩慢增長，而制干棗品種間差異不明顯。

2.4 制干棗和鮮食棗果實發(fā)育過程中糖含量與半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性變化的關(guān)系

由圖4可知，半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性變化呈“M”形，花后60～120 d，是制干棗果實半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性上升最快的時期，140 d后明顯下降;總糖和蔗糖的含量均維持在較高的水平，其間還原糖卻處于整個生育期較高水平。這說明果實中的果糖等還原糖組分在該段時期可能部分用于維生素C合成。特別是在花后160～200 d，雖然蔗糖仍然保持幾乎整個發(fā)育期最高的含量，但還原糖卻處于較低水平，同時可溶性總糖含量也輕微降低，但這并未導(dǎo)致此時維生素C合成和積累降低，而是維持了較高水平。就整個發(fā)育過程而言，這3類糖水平與半乳糖內(nèi)酯脫氫酶積累量之間表現(xiàn)相應(yīng)的直線相關(guān)性。鮮食棗花后60～120 d，糖分積累與維生素C積累量之間表現(xiàn)明顯的直線相關(guān)性，于120 d達到峰值。

2.5 制干棗和鮮食棗果實發(fā)育過程中半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性的變化及其與維生素C積累的關(guān)系

圖5顯示，冬棗果實中半乳糖內(nèi)酯脫氫酶在花后40 d之后開始表現(xiàn)活性，到花后60 d后活性急劇增加，至花后120 d達到最高水平，然后稍有下降，而這一時期也是冬棗維生素C積累最快的時期，花后120 d，隨著冬棗果實的逐漸成熟，半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性雖有所降低，但維生素C含量仍然線性增加;制干棗品種果實中半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性變化與冬棗相似，至花后60 d后活性急劇上升，至花后120 d達到較高水平，隨后緩慢下降，而后緩慢升高至最高，隨后半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性急劇降低，呈現(xiàn)“M”形;60～120 d間維生素C與半乳糖內(nèi)酯脫氫酶呈現(xiàn)相似趨勢，而在160 d后半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性突然下降，相應(yīng)在這一短暫時期維生素C的積累速率下降后變得較為平緩，但保持較高水平。

2.6 制干棗和鮮食棗果實發(fā)育過程中抗壞血酸氧化酶、抗壞血酸氧化物酶、單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶活性的變化

通常在維生素C代謝過程中，在抗壞血酸氧化酶或抗壞血酸氧化物酶作用下維生素C氧化成單脫氫抗壞血酸，進一步形成脫氫抗壞血酸， 同時單脫氫抗壞血酸和脫氫抗壞血酸

可以在單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶作用過程中還原成再生為維生素C。由圖6可見，制干棗和鮮食棗果實快速生長期抗壞血酸氧化酶的活性不斷升高，在花后100 d達到最大值，為花后20 d的2.32倍，然后至花后160 d下降為花后20 d的63.3%，花后160 d以后活性基本維持較低水平，鮮食冬棗抗壞血酸氧化酶活性自60 d后明顯高于制干棗;花后20 d以后至80 d，無論是鮮食棗還是制干棗抗壞血酸氧化物酶活性均明顯高于抗壞血酸氧化酶活性，制干棗品種間差異明顯;花后80 d前制干棗品種和鮮食冬棗幼果抗壞血酸氧化物酶的活性較高，花后140 d達到最小值，快速生長期后逐漸下降，花后120 d后達到花后100 d的 45.1%。制干棗品種果實發(fā)育過程中脫氫抗壞血酸還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶的活性變化基本一致，均在花后120 d達到最大值，分別為花后20 d的4.35倍和2.15倍，至花后140 d下降至花后20 d的1.22倍和2.33倍，花后140 d以后變化趨緩，花后40～120 d，無論是鮮食棗還是制干棗脫氫抗壞血酸還原酶活性均明顯高于單脫氫抗壞血酸還原酶活性，制干棗品種間差異不明顯。

3 討論與結(jié)論

3.1 和田紅棗維生素C含量和積累與半乳糖內(nèi)酯脫氫酶的關(guān)系

和田紅棗因維生素C含量極高而日益受到人們的關(guān)注，研究人員試圖了解和田紅棗積累維生素C的獨特過程，但由于人們過去并不清楚紅棗合成維生素C的過程，所以對這種特殊高積累維生素C的生理機制缺乏較為深入的研究。關(guān)于植物維生素C的研究，1998年以后有了新的進展，植物中維生素C的生物合成路徑才逐漸明朗，尤其是對L-半乳糖途徑及其關(guān)鍵酶的日益明確，才使研究人員可以通過探究該途徑中相關(guān)酶的活性變化及其與維生素C積累間的內(nèi)在關(guān)系，進而揭示和田紅棗果實持續(xù)高積累維生素C的生理生化機制。筆者研究發(fā)現(xiàn)，紅棗果實在發(fā)育過程中半乳糖內(nèi)酯脫氫酶能于較長生育期維持較高活性，從而果實能夠持續(xù)高水平合成維生素C，這可能是和田紅棗果實高積累維生素C的一個關(guān)鍵原因;同時，半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性變化與維生素C積累量之間于60～120 d間存在著明顯的正相關(guān)關(guān)系，這表明和田紅棗果實合成維生素C的含量很大部分受到半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性的調(diào)控。

3.2 和田紅棗維生素C含量與抗壞血酸氧化酶、抗壞血酸氧化物酶、單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶活性的關(guān)系

抗壞血酸氧化酶和抗壞血酸氧化物酶是維生素C代謝過程中主要的氧化分解酶[10]。和田紅棗果實能持續(xù)合成維生素C，同時，由于抗壞血酸氧化物酶在果實發(fā)育前階段的相對較短時期內(nèi)具有較高活性，因而在該時期之后維生素C極少氧化分解，這是和田紅棗果實能夠積累高水平維生素C的另一個關(guān)鍵原因。一方面維生素C在持續(xù)不斷地合成，另一方面其氧化損耗很少，進而使得維生素C能夠高水平積累。維生素C經(jīng)抗壞血酸氧化酶、抗壞血酸氧化物酶等氧化的產(chǎn)物是單脫氫抗壞血酸，單脫氫抗壞血酸一部分能經(jīng)單脫氫抗壞血酸還原酶還原為維生素C，而另一部分能自身發(fā)生歧化反應(yīng)生成維生素C和脫氫抗壞血酸，生成的脫氫抗壞血酸需依賴脫氫抗壞血酸還原酶還原成維生素C[11]。單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶活性在制干棗果實生育中的變化趨勢基本與抗壞血酸氧化酶相似，而與抗壞血酸氧化物酶相反，在果實快速發(fā)育期的120 d均迅速升高到最大，而果實成熟期維持較低水平，抗壞血酸氧化酶和抗壞血酸氧化物酶以及單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶活性平衡點分別在花后100、140 d。不同研究結(jié)果顯示，經(jīng)由提高氧化態(tài)維生素C的再生能力可有效降低維生素C的氧化降解速率，進而明顯增加植物體中維生素C的含量[12-13];而相應(yīng)減少維生素C的氧化降解是提高植物維生素C的一個關(guān)鍵途徑。

3.3 和田紅棗維生素C含量與立地環(huán)境條件促成糖高積累的關(guān)系

和田密植紅棗立地環(huán)境和栽培條件獨特性在于拉長 45 d 的生育期，近乎純沙土和全定量肥水一體化滴灌密植栽培技術(shù)，秋延后持續(xù)加大的晝夜溫差和午后持續(xù)不斷的微風(fēng)，及時吹散葉果表面露水以及極少的秋季降雨的獨特小氣候條件，均給和田紅棗中后期糖分特別是還原糖持續(xù)積累、持續(xù)高水平半乳糖內(nèi)酯脫氫酶活性，以及后期持續(xù)低水平抗壞血酸氧化酶、抗壞血酸氧化物酶、單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶活性營造了獨特外部條件，從而將和田紅棗高積累維生素C內(nèi)在生理與外在條件有機統(tǒng)一。研究和田紅棗維生素C的積累與降解特征對于深入理解和田紅棗果實維生素C獨特積累機制具有重要理論和應(yīng)用價值。

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