番茄抗壞血酸合成代謝研究進(jìn)展

張鳳霞　陶佩文　李漢霞　葉志彪　張余洋（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070）

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番茄抗壞血酸合成代謝研究進(jìn)展

張鳳霞陶佩文李漢霞葉志彪張余洋*
（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070）

摘 要：抗壞血酸是重要的抗氧化劑， 對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用。本文對(duì)番茄中抗壞血酸合成代謝的主要途徑、抗壞血酸合成代謝相關(guān)酶及基因、番茄抗壞血酸合成代謝的調(diào)控等方面進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述，并對(duì)未來的研究方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵字：抗壞血酸；合成代謝；番茄；綜述

張鳳霞，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜分子生物學(xué)與遺傳育種，E-mail：fxzhang322@foxmail.com

抗壞血酸，又名VC，是植物和動(dòng)物體內(nèi)合成的一種己糖內(nèi)酯化合物。它在生物體內(nèi)具有重要的抗氧化作用，是植物和動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖過程中所必需的物質(zhì)（Gilbert et al.， 2009）。抗壞血酸與植物的抗逆性密切相關(guān)，并影響植物細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和植株生長(zhǎng)發(fā)育。人類和一些靈長(zhǎng)類動(dòng)物由于抗壞血酸合成途徑最后一個(gè)關(guān)鍵酶（L-古洛糖醛酸-1，4-內(nèi)酯氧化酶）基因的缺失，自身無法合成抗壞血酸，必須從食物特別是新鮮水果蔬菜中攝取（Watanabe et al.， 2006）。鑒于抗壞血酸在生物體內(nèi)的重要功能，提高植物尤其是蔬菜和水果中抗壞血酸的含量和利用抗壞血酸增強(qiáng)植物抗逆能力的研究顯得十分重要。

番茄果實(shí)含有多種維生素，其中VC含量一般為200～250 mg·kg-1，高者甚至可達(dá)400 mg·kg-1以上?？箟难嵊休^強(qiáng)的還原性，極易受pH、溫度、光照等因素的影響，但在酸性條件下較穩(wěn)定，番茄因富含檸檬酸和蘋果酸所以呈酸性，故番茄中抗壞血酸含量比其他蔬菜要高。近年來，人們對(duì)高等植物中抗壞血酸合成代謝與調(diào)控的研究取得了較大進(jìn)展。本文簡(jiǎn)要論述番茄中抗壞血酸合成代謝與調(diào)控的研究進(jìn)展。

1　抗壞血酸在番茄中的生理功能

抗壞血酸是廣泛存在于植物中的高豐度的小分子抗氧化物質(zhì)，在植物代謝過程中不可缺少。植物抗壞血酸的生理功能概括起來包括以下幾方面：① 作為酶的輔因子?？箟难嶙鳛榱u脯氨酸的輔酶，參與細(xì)胞壁的形成。番茄中GDP-D-甘露糖-3′，5′-異構(gòu)酶（GME）基因沉默后，不僅影響抗壞血酸合成，而且調(diào)控細(xì)胞壁非纖維素物質(zhì)的合成（Gilbert et al.， 2009）。② 參與細(xì)胞分化與細(xì)胞膨大。通過RNAi干涉番茄線粒體L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GLDH）基因的表達(dá)，抗壞血酸的氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，同時(shí)番茄葉片和果實(shí)明顯減?。ˋlhagdow et al.， 2007）?？箟难崤c植物激素也存在互作（Davey et al.， 2000）。③ 與光合作用有關(guān)。超量表達(dá)番茄類囊體抗壞血酸過氧化物酶（tAPX）基因，轉(zhuǎn)基因番茄凈光合速率和PSⅡ的最大光反應(yīng)效率提高；反義抑制tAPX基因表達(dá)，番茄光合效率降低（Duan et al.， 2012a， 2012b）。抑制番茄抗壞血酸氧化酶（AO）基因的表達(dá)，在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株比正常植株的光合作用能力增強(qiáng)（Zhang et al.， 2010）。在番茄中超量表達(dá)馬鈴薯脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR1和DHAR2）基因，不僅提高了抗壞血酸含量，而且轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量和光合速率均高于對(duì)照（Li et al.， 2012）。④ 具有抗氧化作用。抗壞血酸能夠清除氧化代謝、光合作用和環(huán)境脅迫等產(chǎn)生的活性氧（ROS）。超量表達(dá)GME1、GME2基因的番茄植株耐鹽性、抗旱性和抗氧化性都有一定程度的提高；轉(zhuǎn)抗壞血酸肌醇氧酶（MIOX）基因的番茄植株抗氧化性也有一定的提高（劉軍霞， 2009）。

2　番茄中抗壞血酸的生物合成與代謝

圖1　高等植物中抗壞血酸合成與代謝途徑

Smirnoff（1996）提出了植物抗壞血酸合成的L-半乳糖途徑，標(biāo)志著植物抗壞血酸生物合成機(jī)制基本明確。其他一些抗壞血酸生物合成支路途徑也陸續(xù)被提出，包括半乳糖醛酸途徑、古洛糖途徑和肌醇途徑（圖1）。目前的證據(jù)表明，番茄中抗壞血酸合成的主要途徑是L-半乳糖途徑。但飼喂實(shí)驗(yàn)表明，在番茄成熟果實(shí)中半乳糖醛酸途徑可能也發(fā)揮一定作用（Badejo et al.， 2012）。在番茄中異源表達(dá)草莓D-半乳糖醛酸還原酶（GalUR） 基因，番茄果實(shí)中的抗壞血酸含量顯著提高，從側(cè)面揭示了番茄中可能存在抗壞血酸合成的半乳糖醛酸途徑（張嬋娟，2011）。另外，番茄飼喂肌醇后抗壞血酸含量提高，表明肌醇途徑可能也在番茄抗壞血酸合成中發(fā)揮作用（劉軍霞， 2009）。

抗壞血酸在植物體內(nèi)合成后在抗壞血酸過氧化物酶（APX）和抗壞血酸氧化酶（AO）的作用下，氧化成單脫氫抗壞血酸（MDHA）。MDHA可在單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）的作用下重新轉(zhuǎn)變成抗壞血酸，或者經(jīng)非酶作用形成脫氫抗壞血酸（DHA）（Smirnoff & Wheeler， 2000）。脫氫抗壞血酸可在脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的催化作用下生成抗壞血酸，此反應(yīng)過程需要利用還原型谷胱甘肽（GSH）作為還原劑，因此該反應(yīng)也稱為谷胱甘肽-抗壞血酸的循環(huán)（Noctor et al.， 2000）。

植物抗壞血酸首先在線粒體內(nèi)膜上合成，然后再運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)其他亞細(xì)胞區(qū)室和質(zhì)外體中（Bartoli et al.， 2010）。由于調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)運(yùn)體系的存在，抗壞血酸能夠根據(jù)生理、發(fā)育和代謝的需要在不同細(xì)胞區(qū)間迅速轉(zhuǎn)移，因此植物不同組織抗壞血酸含量存在差異。哺乳動(dòng)物中抗壞血酸受到抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SVCT）的作用，番茄中也存在12個(gè)與抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源的基因（SlNAT），其作用機(jī)理有待闡明（Cai et al.， 2013）。

3　番茄抗壞血酸合成代謝相關(guān)酶及基因

3.1甘露糖磷酸變位酶（PMM）

甘露糖磷酸變位酶（PMM）將D-甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為D-甘露糖-1-磷酸。Qian等（2007）從番茄中克隆了PMM基因的全長(zhǎng)cDNA序列，編碼252個(gè)氨基酸，與人類和酵母的PMM基因相似性大于50%。Badejo等（2008）研究發(fā)現(xiàn)番茄中PMM酶的活力與抗壞血酸的含量存在一定的相關(guān)性。

3.2GDP-D-甘露糖磷酸化酶（GMP）

GDP-D-甘露糖磷酸化酶（GMP）是抗壞血酸合成途徑中的第一個(gè)限速酶，起著非常關(guān)鍵的作用，其催化產(chǎn)物GDP-D-甘露糖是細(xì)胞壁多糖合成和蛋白質(zhì)糖基化的底物。番茄GMP基因（GenBank注冊(cè)號(hào)：AY60566）全長(zhǎng)1 535 bp，共編碼361個(gè)氨基酸，位于番茄第3號(hào)染色體。植物GMP氨基酸序列具有高度保守性，番茄GMP是一種膜蛋白。GMP基因在番茄根、莖、葉、花、果實(shí)中的表達(dá)存在差異（鄒禮平， 2005）。王華森（2008）克隆到了另外一個(gè)番茄GMP基因（GenBank注冊(cè)號(hào)：DQ449030），該基因在番茄不同器官中呈非特異性表達(dá)，在葉片中表達(dá)量最高，果實(shí)中表達(dá)量其次，莖、根中表達(dá)量最少。

3.3GDP-D-甘露糖-3′，5′-異構(gòu)酶（GME）

GME催化2個(gè)不同差向異構(gòu)反應(yīng)，一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生GDP-L-半乳糖，另一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生GDP-L-古洛糖，該酶作用于糖核苷水平上抗壞血酸生物合成的第一步。GME基因在多數(shù)植物中以單拷貝形式存在，但是在番茄中含有2個(gè)GME基因（Watanabe et al.， 2006）。鄒禮平（2005）利用番茄IL系群體采用RFLP的方法將番茄GME2基因定位于9-J區(qū)。Stevens等（2007）利用3個(gè)不同的番茄群體對(duì)番茄紅熟果實(shí)中抗壞血酸合成相關(guān)基因進(jìn)行了QTL定位，并結(jié)合鄒禮平基因定位的結(jié)果提出了GME基因可能在番茄抗壞血酸合成中發(fā)揮著非常重要的作用。

張嬋娟（2011）克隆了番茄GME基因家族中的2個(gè)基因SlGME1（GenBank注冊(cè)號(hào)：GQ150164）和SlGME2（GenBank注冊(cè)號(hào)：GQ150165）。2個(gè)基因均包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，開放閱讀框均為1 131 bp，編碼376個(gè)氨基酸，2個(gè)基因高度保守，并且2個(gè)GME蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)中。SlGME1與SlGME2在番茄根、莖、葉、花和果實(shí)中均呈組成型表達(dá)，但不同組織間表達(dá)水平存在差異。

3.4GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP）

GGP可以催化GDP-L-半乳糖轉(zhuǎn)化成L-半乳糖-1-磷酸， 在番茄抗壞血酸合成中可能起著關(guān)鍵的作用。已在番茄葉片中克隆到GGP基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為SlGGP （GenBank注冊(cè)號(hào)：JQ517313）。該基因與馬鈴薯、煙草和擬南芥等的GGP基因高度同源，具有2個(gè)保守區(qū)，即HIT （histidine triad）和 NLS （nuclear localizationsequence）。同時(shí)將SlGGP基因產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。SlGGP基因在葉片中表達(dá)量最高（王麗燕， 2012）。

3.5L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GLDH）

L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GLDH）是抗壞血酸L-半乳糖合成途徑中最后一個(gè)關(guān)鍵酶。鄒禮平（2005）將番茄GLDH基因（GenBank注冊(cè)號(hào)：AB080690）定位于第10號(hào)染色體E區(qū)域。該基因包含1個(gè)長(zhǎng)為1 767 bp的完整編碼框，編碼588個(gè)氨基酸，前85個(gè)氨基酸是線粒體定位結(jié)構(gòu)域序列，在第136個(gè)氨基酸處存在FAD結(jié)合位點(diǎn)。番茄GLDH的氨基酸序列與煙草、擬南芥、草莓等的GLDH氨基酸序列同源性達(dá)73%～86%。

3.6肌醇氧酶（MIOX）

MIOX可以將肌醇氧化為D-葡萄糖醛酸，是植物抗壞血酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一。超量表達(dá)番茄MIOX基因可以提高番茄植株的抗壞血酸含量，并且植株的抗氧化性有一定的提高。在高溫脅迫下番茄MIOX基因表達(dá)量增加，在高鹽脅迫下表達(dá)量降低（劉軍霞， 2009）。

3.7單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）

番茄抗壞血酸代謝途徑中促進(jìn)抗壞血酸再生的MDHAR1基因編碼433個(gè)氨基酸（鄒禮平，2005）。脫氧抗壞血酸酶是抗壞血酸再生途徑的另一重要酶，現(xiàn)已克隆到了2個(gè)DHAR基因。DHAR1基因（GenBank注冊(cè)號(hào)：AY971873）屬于胞質(zhì)類型，位于番茄第2號(hào)染色體，而DHAR2基因（GenBank注冊(cè)號(hào)：AY971874）屬于質(zhì)體類型，位于第8號(hào)染色體。DHAR1基因在番茄各個(gè)器官中都有表達(dá)，而DHAR2基因僅在葉片中表達(dá)（Zou et al.， 2006）。

3.8抗壞血酸過氧化物酶（APX）

抗壞血酸過氧化物酶利用抗壞血酸作為電子供體將H2O2還原為H2O，并產(chǎn)生單脫氫抗壞血酸。鄒禮平（2005）克隆到1個(gè)番茄胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶基因cAPX（GenBank注冊(cè)號(hào)：AY974805），該基因與煙草、豌豆、水稻等胞質(zhì)APX同源性均在75%以上。在茄科植物中，番茄cAPX基因與馬鈴薯的cAPX高度同源。王偉青（2003）克隆到1個(gè)約405 bp的番茄類囊體膜APX基因（LetAPX）片段，并進(jìn)一步獲得全長(zhǎng)cDNA（GenBank注冊(cè)號(hào)：AF413573）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LetAPX 有利于保護(hù)葉綠體等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)免受低溫破壞。段明（2012）從番茄中分離到類囊體膜抗壞血酸過氧化物酶基因，該基因編碼1個(gè)包含421個(gè)氨基酸的蛋白，與煙草、南瓜、冰葉日中花的 tAPX 蛋白序列同源性較高，并將LetAPX蛋白定位于葉綠體。LetAPX有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，domainⅠ是APX的激活位點(diǎn)，domainⅡ是 APX 與血紅素的結(jié)合位點(diǎn)。

3.9抗壞血酸氧化酶（AO）

抗壞血酸氧化酶催化抗壞血酸氧化產(chǎn)生單脫氫抗壞血酸。鄒禮平（2005）克隆了番茄AO基因的全長(zhǎng)cDNA（GenBank注冊(cè)號(hào)：AY971876），該cDNA全長(zhǎng)為1 984 bp，編碼578個(gè)氨基酸。舒文波（2006）發(fā)現(xiàn)AO基因的啟動(dòng)子結(jié)合蛋白AOBP可以調(diào)控番茄果實(shí)中抗壞血酸含量和AO酶的活性。

4　番茄抗壞血酸合成代謝的調(diào)控

番茄抗壞血酸不同的合成途徑和氧化循環(huán)再生途徑構(gòu)成了復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，但目前有關(guān)番茄抗壞血酸合成代謝調(diào)控機(jī)制的研究還不夠深入。番茄抗壞血酸合成代謝調(diào)控的外界因素包括以下幾方面：① 光照對(duì)番茄抗壞血酸的合成代謝起著重要作用。番茄植株經(jīng)遮光處理后，葉片和果實(shí)中總抗壞血酸含量降低，抗壞血酸合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量也發(fā)生變化。光照對(duì)番茄葉片中抗壞血酸含量和抗壞血酸合成相關(guān)基因表達(dá)的影響比果實(shí)中更顯著（Massot et al.， 2012）。② 溫度可以調(diào)控番茄抗壞血酸合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)。對(duì)番茄植株進(jìn)行逆境處理，發(fā)現(xiàn)低溫可誘導(dǎo)GME基因的表達(dá)，高溫可誘導(dǎo)MIOX基因的表達(dá)（劉軍霞， 2009）。③ 激素對(duì)抗壞血酸的合成代謝具有重要調(diào)控作用。在額外添加激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)番茄幼苗，幼苗根部DHAR活性下降，脫氫抗壞血酸含量增加（Tyburski et al.， 2007）。生長(zhǎng)素誘導(dǎo)條件下單性結(jié)實(shí)的櫻桃番茄中抗壞血酸含量變化雖不明顯，但GLDH和GME基因的相對(duì)表達(dá)量有顯著變化（Tsaniklidis et al.， 2012）。④ 抗壞血酸具有反饋調(diào)節(jié)的作用。轉(zhuǎn)GME1、GME2基因番茄植株飼喂抗壞血酸，GME活性受到抑制（劉軍霞， 2009）。

5　轉(zhuǎn)基因技術(shù)在番茄抗壞血酸合成與代謝研究中的應(yīng)用

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日漸成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在番茄抗壞血酸合成代謝的研究中得到了廣泛應(yīng)用。張琳（2009）在番茄中超量表達(dá)GMP基因，番茄葉片中GMP活性、抗壞血酸含量以及抗壞血酸代謝其他相關(guān)酶活性都有不同程度的提高。在番茄中超量表達(dá)SlGME基因，葉片和果實(shí)中抗壞血酸含量提高，并且對(duì)非生物脅迫的抗性也有一定程度的提高（Zhang et al.， 2011a）。抑制番茄SlGGP基因的表達(dá)，抗壞血酸合成途徑中位于SlGGP上游的基因表達(dá)受到影響，番茄抗壞血酸含量降低，植株的冷敏感性提高（王麗燕， 2012）。李艷（2013）抑制番茄GGP基因的表達(dá)，番茄葉片和果實(shí)總抗壞血酸含量顯著降低。超量表達(dá)GPP1和GPP2基因，番茄葉片中總抗壞血酸含量均有所提高。鄒禮平（2005）超量表達(dá)GLDH基因，番茄植株中GLDH活性顯著增高，抗壞血酸含量顯著增加；該基因的干涉植株中GLDH活性降低，抗壞血酸含量降低。李青竹（2011）在番茄中超量表達(dá)馬鈴薯DHAR基因家族的2個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)DHAR1基因后，番茄植株葉片和果實(shí)中的DHAR活性和抗壞血酸含量均升高，而超量表達(dá)DHAR2基因后，僅葉片中的DHAR活性和抗壞血酸含量有一定程度的升高。在番茄中超量表達(dá)MDHAR基因，MDHAR活性提高，葉片中抗壞血酸含量提高，但果實(shí)中的抗壞血酸含量下降（Haroldsen et al.， 2011）。抑制番茄中線粒體APX基因的表達(dá)，APX基因表達(dá)量減少，APX活性降低，果實(shí)中抗壞血酸含量增加（Zhang et al.， 2011b）。

6　展望

抗壞血酸在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著很重要的作用，越來越多的證據(jù)表明，抗壞血酸不僅是一種抗氧化物質(zhì)，更多的作用在于作為生長(zhǎng)因子參與對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物抗壞血酸合成代謝研究取得很大進(jìn)展。番茄中抗壞血酸合成與代謝途徑已被較清晰地闡明，抗壞血酸合成代謝途徑主要關(guān)鍵酶基因先后得到克隆和功能鑒定。目前抗壞血酸代謝的研究多集中在主要代謝通路，而支路途徑還有待解析?？箟难嵴{(diào)控機(jī)制特別是轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控因子還有待發(fā)掘?？箟难岷铣纱x研究過程中，抗壞血酸對(duì)葉片衰老、頂端分生組織等生長(zhǎng)發(fā)育的影響機(jī)理還有待闡明。全基因組關(guān)聯(lián)分析以及突變體庫(kù)等研究手段將加深對(duì)抗壞血酸合成代謝機(jī)制及作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)。

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Research Progress in Tomato Ascorbic Acid Biosynthesis and Metabolism

ZHANG Feng-xia， TAO Pei-wen， LI Han-xia， YE Zhi-biao， ZHANG Yu-yang*
（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology， Ministry of Education， Huazhong Agricultural University， College Horticulture and Forestry Sciences，Wuhan 430070， Hubei，China）

Abstract：Ascorbic acid is an important antioxidant synthesized in plant. It has an important role in plant growth and development. Biosynthesis and metabolism of ascorbic acid is summarized and its metabolism regulation in tomato is emphasized in this paper. The future research direction about ascorbic acid metabolism is also prospected.

Key words：Ascorbic acid； Biosynthesis and metabolism； Tomato； Summary

*通訊作者（

Corresponding author）：張余洋，男，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：番茄分子生物學(xué)與分子育種，E-mail：yyzhang@mail.hzau. edu.cn

收稿日期：2015-07-06；接受日期：2015-10-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目（2011CB100600），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171974）