發(fā)酵前后不同分子量段全蝎白術(shù)混合品體外抗腫瘤研究

毛會(huì)秀 陳美琦 劉金虎 呂迎蘭 方園 張瑞 王集會(huì)

摘要：目的? 研究全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品的抗腫瘤活性，確定藥物抗腫瘤的活性部位。方法? 依據(jù)雙指標(biāo)優(yōu)化提取工藝的最優(yōu)條件對(duì)全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品進(jìn)行超聲提取。采用超濾手段，分別用截留量為5 kD和10 kD的超濾膜對(duì)水提液進(jìn)行超濾分段，測(cè)定各分子量段中蛋白質(zhì)和多糖的含量，采用MTT法檢測(cè)體外抗腫瘤活性，并以未發(fā)酵品做對(duì)照。結(jié)果? 各分子量段對(duì)2種腫瘤細(xì)胞抑制效果具有差異性，醇沉上清液對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果最好，其次為分子量段>10 kD全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品，且全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用顯著優(yōu)于未發(fā)酵品。結(jié)論? 全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品對(duì)乳腺癌細(xì)胞、喉癌細(xì)胞均有較高的抑制作用，其活性部位主要為醇沉上清液和分子量段>10 kD全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品。

關(guān)鍵詞：全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品;超濾分段;抗腫瘤

中圖分類號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）07-0040-04

Abstract： Objective To study the antitumor activity of Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product; To determine the antitumor active sites of Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product. Methods Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product was extracted by ultrasonic assay on the basis of the optimal conditions of the double index optimization extraction process. The water extract was segmented by ultrafiltration membrane with a retention of 5 kD and 10 kD respectively. The contents of protein and polysaccharide in each molecular weight segment were determined. MTT assay was used to study the antitumor activity in vitro. The unfermented product was used as the control group. Results The inhibitory effects of different molecular weight segment on the two tumor cells were different， and the inhibitory effects of alcohol supernatant on the tumor cells were the best， followed by the SAHFP of molecular weight >10 kD segment. Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product was significantly better than that of unfermented products. Conclusion Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product has a high inhibitory effect on breast cancer cells and laryngeal cancer cells. The active sites of antitumor drugs are mainly the alcohol supernatant and the Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product of molecular weight >10 kD segment.

Keywords： Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation; ultrafiltration segment; antitumor

全蝎為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch的干燥體[1]143，主要活性成分為蝎毒，其毒性強(qiáng)烈，若服用不當(dāng)，會(huì)出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)。因此，臨床使用時(shí)需進(jìn)行合理的藥物配伍，進(jìn)而降低全蝎的毒性，最大程度發(fā)揮其藥效?！夺t(yī)宗金鑒》認(rèn)為可用全蝎、僵蠶為醒脾湯化痰治標(biāo)，更用人參、茯苓、白術(shù)溫補(bǔ)中氣，恢復(fù)脾氣健運(yùn)，助化痰祛邪，使邪去而不傷正。白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水功效[1]103。王彥多等[2]將攻毒散結(jié)的全蝎與健脾益氣的白術(shù)相配伍，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌發(fā)酵的全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品（SAHFP）提取液具有顯著的抗腫瘤作用。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)有效部位進(jìn)行探討，以期通過(guò)超濾分段分離SAHFP中有效成分，進(jìn)一步明確抗腫瘤活性部位，為該藥物成分及其他中藥配伍研究提供參考。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 藥材和菌種

全蝎，購(gòu)自山東臨沂沂水;白術(shù)，購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民副教授鑒定分別為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎的干燥體和菊科植物白術(shù)的干燥根莖。菌種為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所自篩菌株[桃5（球孢白僵菌）Beauveria bassiana（Bals.）Vuill]。

1.2? 主要試劑與儀器

1640細(xì)胞培養(yǎng)基（Hylcone-賽默飛世爾生物制品北京有限公司），牛血清蛋白，胰酶細(xì)胞消化液;Folin-酚試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸、酒石酸鉀鈉等均為分析純。KQ-500GVDV型雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），WT600-2J型超濾儀（上海摩速科學(xué)器材有限公司），DNM-9602酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），LGJ-18A型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）。

1.3? 細(xì)胞株

乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和喉癌Hep-2細(xì)胞株，均由山東省立醫(yī)院提供。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品制備

白僵菌菌種制備：用接種針取桃5（球孢白僵菌）活化菌種適量，無(wú)菌接種至PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d，將第2代菌種用蒸餾水稀釋成含有1×108個(gè)孢子/mL白僵菌孢子的混懸液備用。

SAHFP制備：全蝎粉、白術(shù)粉按1∶1比例混合，加白僵菌孢子混懸液適量潤(rùn)濕，攪拌均勻，溫度25 ℃、濕度95%以上環(huán)境，自然光照，發(fā)酵7 d，長(zhǎng)滿菌絲后停止發(fā)酵，取出冷凍干燥，得凍干粉備用。

2.2? 全蝎白術(shù)混合發(fā)酵品水提液制備

精密稱取1.000 0 g SAHFP置于100 mL具塞錐形瓶，按雙指標(biāo)優(yōu)化工藝中最優(yōu)提取條件進(jìn)行提取[3]，重復(fù)提取2次，離心、抽濾，得濾液備用，未發(fā)酵的全蝎白術(shù)混合品同法處理作為對(duì)照。

2.3? 水提液醇沉

將“2.2”項(xiàng)下得到的濾液進(jìn)行醇沉[3]，使成80%醇溶液，密封，置于4 ℃冰箱，靜置過(guò)夜。將得到的醇溶液過(guò)濾，回收上清液中乙醇，并冷凍干燥，得上清液凍干粉。分離的沉淀物用一定比例蒸餾水溶解，過(guò)濾，除去不溶于水物質(zhì)，再用8 μm濾膜進(jìn)行抽濾，除去大分子硬顆粒物，得到待超濾液。未發(fā)酵混合品的超濾水提液同以上步驟。

2.4? 待超濾液分段

在0.5～1.0 MPa壓力范圍內(nèi)用蒸餾水沖洗10 kD和5 kD超濾膜各20 min，再對(duì)待超濾液進(jìn)行超濾分段，循環(huán)多次，分別得到分子量段>10 kD、5～10 kD和<5 kD的溶液，將3組分子量段溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到不同分子量段凍干粉備用。

2.5? 蛋白質(zhì)和多糖含量測(cè)定

采用改良Lorry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[4]，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.002 4X+0.010 4，r=0.999 2。稱取一定量“2.3”“2.4”項(xiàng)獲得的凍干粉，加水溶解，于650 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同分子量段的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算不同分子量段蛋白質(zhì)得率。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，得到多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.016 1X-0.002 4，r=0.999 7。稱取一定量“2.3”“2.4”項(xiàng)獲得的凍干粉，加水溶解，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同分子量段的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算不同分子量段多糖得率。

2.6? 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

2.6.1? 溶液配制

稱取不同分子量段凍干粉各10 mg，溶于5 mL 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，配成初始濃度為2 mg/mL的溶液，無(wú)菌條件下0.22 μm濾膜過(guò)濾，然后用1640細(xì)胞培養(yǎng)基逐步稀釋，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL濃度溶液。

2.6.2? MTT法檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞、喉癌Hep-2細(xì)胞胰酶消化，加入1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度為1×106/mL，以每孔100 μL接種到96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去上清液，每孔加入配好的藥物溶液100 μL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照組加入不含血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL，陽(yáng)性對(duì)照組加入100 μg/mL順鉑100 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔避光加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，放入培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h。吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO，搖勻，于酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定OD值，并計(jì)算不同分子量段對(duì)腫瘤（乳腺癌、喉癌）細(xì)胞的抑制率。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 發(fā)酵前后不同分子量段凍干粉蛋白質(zhì)、多糖得率比較

SAHFP中蛋白質(zhì)主要集中在醇沉上清液中，而多糖集中于分子量段>10 kD藥液中，見表1。該分子量段藥液中多糖并非全部來(lái)自白術(shù)，全蝎中也有部分多糖如酸性黏多糖等，并且在真菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了許多次生代謝物質(zhì)如聚酮類物質(zhì)，主要為大分子物質(zhì)。

4.2? 不同分子量段凍干粉對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制率的影響

0.3、0.4 mg/mL SAHFP和未發(fā)酵品對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制率有顯著差異，而0.5 mg/mL SAHFP和未發(fā)酵品對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制率無(wú)明顯差異;SAHFP和未發(fā)酵醇沉上清液對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率隨濃度的升高而升高，但未發(fā)酵上清液抑制率均低于SAHFP的抑制率。見圖1A。SAHFP和分子量段>10 kD未發(fā)酵品對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率有顯著差異;分子量段>10 kD SAHFP對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率均高于分子量段>10 kD未發(fā)酵品，可明顯看出在該分子量段發(fā)酵品對(duì)腫瘤的抑制效果高于未發(fā)酵品。見圖1B。分子量段5～10 kD SAHFP和未發(fā)酵品對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率有顯著差異，分子量段5～10 kD SAHFP和未發(fā)酵品無(wú)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用;分子量段5～10 kD未發(fā)酵品濃度達(dá)0.8 mg/mL和1.0 mg/mL時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用，但抑制率較低，均未超過(guò)10%。見圖1C。

4.3? 不同分子量段凍干粉對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞抑制率的影響

SAHFP和未發(fā)酵品醇沉上清液對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞抑制率有顯著差異;在一定濃度下，兩者對(duì)腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用，且SAHFP的抑制效果更顯著。見圖2A。分子量段>10 kD SAHFP和未發(fā)酵品對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞抑制率有顯著差異，SAHFP對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制效果遠(yuǎn)高于未發(fā)酵品，且SAHFP對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率隨濃度的升高而升高。見圖2B。分子量段5～10 kD SAHFP和未發(fā)酵品對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，二者差異顯著;但對(duì)腫瘤細(xì)胞均無(wú)抑制效果。見圖2C。

5? 討論

由表1可知，通過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)，SAHFP與未發(fā)酵品比較，總蛋白質(zhì)含量減少，多糖含量增加;通過(guò)超濾后各分子量段蛋白質(zhì)含量研究發(fā)現(xiàn)，SAHFP中蛋白質(zhì)主要集中在醇沉上清液中，而未發(fā)酵混合品醇沉上清液中蛋白質(zhì)含量較少，說(shuō)明在微生物發(fā)酵過(guò)程中，大分子蛋白被酶解為小分子蛋白和肽類，因?yàn)橐话阃ㄟ^(guò)80%乙醇沉淀，小分子肽類能溶于其中，而大分子蛋白質(zhì)則因?yàn)樗瘜悠茐亩恋砦龀?。?duì)多糖而言，分子量段>10 kD藥液中多糖含量明顯高于醇沉上清液中多糖含量，且SAHFP多糖含量比未發(fā)酵品高，說(shuō)明白僵菌中其他物質(zhì)（氨基酸、脂肪酸等）通過(guò)特定的途徑（糖異生等）合成大量的多糖類物質(zhì)。

通過(guò)對(duì)2組腫瘤細(xì)胞抑制率分析發(fā)現(xiàn)，SAHFP對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果均高于未發(fā)酵品，且醇沉上清液的抑制效果最為明顯;分子量段>10 kD SAHFP，對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率隨濃度的升高而逐漸升高，而未發(fā)酵品則表現(xiàn)出相反的作用效果，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用?？傊?，通過(guò)微生物發(fā)酵，可顯著增強(qiáng)體外抗腫瘤細(xì)胞株的作用。

蝎毒作為全蝎藥理作用的主要有效成分，分子量在6000～9000 D，但也有3000 D或大于10 000 D，同時(shí)蝎毒具有蛋白質(zhì)的通性，易被乙醇溶液沉淀，沉淀物可再?gòu)?fù)溶于水[5]。多糖也屬于生物大分子，可通過(guò)乙醇沉淀析出。侯軒等[6]通過(guò)凝膠滲透色譜法測(cè)定白術(shù)多糖的分子量為4360 D，同時(shí)白術(shù)多糖可促進(jìn)人胃癌細(xì)胞的凋亡[7]。本實(shí)驗(yàn)選擇80%醇溶液進(jìn)行醇沉，得到的沉淀物以多糖和蛋白質(zhì)為主，超濾膜選擇截流量為5 kD和10 kD兩種，對(duì)SAHFP和未發(fā)酵品進(jìn)行雙重超濾分段，從而對(duì)抗腫瘤的活性部位進(jìn)行了可靠的判定。

中藥提取液進(jìn)行醇沉，不僅可除去一些雜質(zhì)，還使一部分有效成分流失，故一定要緩慢加入乙醇，快速攪動(dòng)藥液，避免局部醇濃度過(guò)大，造成有效成分的損失;醇沉后的上清液不能隨意舍棄，應(yīng)一并進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)比較。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究表明，醇沉上清液中小分子物質(zhì)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞、喉癌Hep-2細(xì)胞均具有顯著的抑制效果，該物質(zhì)沒有因發(fā)酵而被破壞，而且通過(guò)發(fā)酵，SAHFP對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用顯著增強(qiáng)，尤其是分子量段>10 kD的物質(zhì)發(fā)酵后抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未發(fā)酵品，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程會(huì)增強(qiáng)全蝎、白術(shù)兩者對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。本研究主要觀察全蝎白術(shù)配伍增加抗腫瘤的效果，未涉及全蝎白術(shù)配伍減輕毒性的研究，這是今后深入研究的重點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-12-14）