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    BRAF激酶抑制劑的研究進(jìn)展

    2015-03-20 07:41:54許常旭陳莉査曉明
    醫(yī)學(xué)信息 2015年7期
    關(guān)鍵詞:抗腫瘤

    許常旭 陳莉 査曉明

    摘要:MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化,尤其在多種腫瘤細(xì)胞中異?;钴S。BRAF激酶是Raf家族在MAPK信號(hào)通路中最重要的亞型,其過多表達(dá)或突變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),同時(shí)它的易激活、易突變和基礎(chǔ)酶活高等特點(diǎn)使其成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱門靶標(biāo)。因此,基于BRAF靶標(biāo)的抗腫瘤抑制劑日益受到研究者的關(guān)注。本文對(duì)近來(lái)年國(guó)內(nèi)外研究的BRAF抑制劑作一綜述

    關(guān)鍵詞:BRAF激酶;BRAF抑制劑;抗腫瘤

    促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)是人體內(nèi)最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Raf是MAPK通路中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,承接上游Ras信號(hào),傳遞給下游MEK/ERK,影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。BRAF作為Raf家族在MAPK信號(hào)通路中最重要的亞型,其過量表達(dá)或突變都可能誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1]。因此基于BRAF靶標(biāo)的BRAF抑制劑已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。本文就近幾年國(guó)內(nèi)外對(duì)BRAF抑制劑在抗腫瘤方面的研究進(jìn)展作一綜述。

    1 BRAF激酶及活性調(diào)節(jié)

    BRAF激酶包含3個(gè)保守區(qū)域,分別是RAS結(jié)合域、富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域。它的催化活性中心包括鉸鏈區(qū)(hinge region, hinge)、磷酸環(huán) (phosphate-binding loop, P-loop)、αC螺旋(αC helix) 以及活化環(huán)(activation loop, A-loop),并且與ATP結(jié)合位點(diǎn)有部分重合。同時(shí),它存在活性(Type I)和非活性(Type II)兩種構(gòu)象。當(dāng)處于Type I狀態(tài)時(shí),A-loop處于打開狀態(tài),但當(dāng)A-loop起點(diǎn)的三個(gè)保守氨基酸(Asp594-Phe595-Gly596)組成的DFG基序圍繞Asp594向αC helix方向旋轉(zhuǎn)8A,出現(xiàn)一個(gè)疏水結(jié)合區(qū)(也稱為變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)),則轉(zhuǎn)變成Type II構(gòu)象。正常情況下,BRAF依靠P-loop與A-loop之間的疏水作用而維持著Type II構(gòu)象,但當(dāng)活化的Ras將BRAF招募至細(xì)胞膜時(shí),A-loop上的Ser599和Thr602發(fā)生磷酸化,破壞了兩者的穩(wěn)定作用,DFG基序發(fā)生旋轉(zhuǎn),BRAF轉(zhuǎn)變?yōu)門ype I構(gòu)象[2]。

    BRAF在7~8%的腫瘤細(xì)胞中存在突變,其中90%是braf基因外顯子15的第1799位核苷酸T突變?yōu)锳,導(dǎo)致其編碼的600位纈氨酸被谷氨酸取代,即BRAFV600E。BRAFV600E突變模擬了野生BRAF S599/T602(BRAFWT)的磷酸化,破壞P-loop和A-loop之間的疏水作用,使BRAF在沒有上游Ras激活的作用下仍然處于異常激活狀態(tài)。這種突變使得BRAFV600E的激酶活性是BRAFWT的500倍,能持續(xù)性激活MEK/ERK信號(hào)通路,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲轉(zhuǎn)移。

    2 BRAF抑制劑

    目前,根據(jù)抑制劑與激酶的不同構(gòu)象相互作用,可將BRAF抑制劑也可分為I型抑制劑和II型抑制劑。

    2.1 I型抑制劑 型抑制劑結(jié)合BRAF的Type I構(gòu)象,是ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。它主要通過模擬ATP的腺嘌呤環(huán)與鉸鏈區(qū)形成氫鍵作用,錨定在激酶片層間,伸展開來(lái)的疏水基團(tuán)占據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn),而起到抑制激酶活性的效果。目前已成功上市的I型抑制劑是Vemurafenib (PLX4032)和Dabrafenib (GSK-2118436)。

    2.1.1 Vemurafenib (PLX4032,1)

    Vemurafenib是一種新型的特異性BRAFV600E口服抑制劑,于2011年8月被FDA批準(zhǔn)用于治療BRAFV600E突變的晚期轉(zhuǎn)移性或不能切除的黑色素瘤。該藥物是片段藥物設(shè)計(jì)原理的經(jīng)典案例:Plexxikon公司對(duì)200萬(wàn)個(gè)小分子進(jìn)行激酶抑制率初篩、共晶分析得到一個(gè)廣譜的激酶抑制劑母核--7-氮雜吲哚(7-azaindole,2);再通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)改造得到特異性BRAFV600E抑制劑先導(dǎo)物--PLX4720(3);最后為改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)在母核5位插入一個(gè)苯環(huán)得到Vemurafenib[3]。

    Vemurafenib作為首個(gè)治療黑色素瘤的個(gè)體化靶向藥物,療效迅速,治療反應(yīng)率良好;但靶標(biāo)的專一性使其對(duì)機(jī)體的代償作用和信號(hào)旁路無(wú)效,黑色素瘤患者常在Vemurafenib治療8~9月后出現(xiàn)耐藥性問題。目前,這種耐藥性有望通過聯(lián)合用藥得到解決,GSK與Roche正在合作進(jìn)行Vemurafenib的靶向療法聯(lián)合易普利姆瑪(Ipilimumab)的免疫療法來(lái)治療晚期黑色素瘤的臨床試驗(yàn)[4]。

    Steve等[5]根據(jù)生物電子等排原理改造Vemurafenib得到磺酰胺類BRAF激酶抑制劑4和5,其抑制BRAF的IC50分別為38和4.8nM。后續(xù)進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造得到酶(IC50=0.3nM)和細(xì)胞(IC50=6nM)抑制活性更佳的化合物6,且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明6藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)較好,口服有效[6]。

    2.1.2 Dabrafenib (GSK-2118436,7)

    Dabrafenib是GSK公司開發(fā)的另一個(gè)新型口服靶向Type I BRAF抑制劑,已于2013年5月獲FDA批準(zhǔn)用于治療不可切除的或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤[7]。臨床發(fā)現(xiàn),它與Vemurafenib類似,在治療6~7個(gè)月后出現(xiàn)耐藥性問題。為了克服耐藥性,GSK和日本Tobacco公司合作開發(fā)Dabrafenib和MEK抑制劑Trametinib的復(fù)方制劑,并于2014年1月上市用于治療BRAFV600E突變的黑色素瘤[8]。

    2.1.3三芳基咪唑類化合物 三芳基咪唑類抑制劑是靶向激酶Type I構(gòu)象的經(jīng)典I型抑制劑,它包括一個(gè)N雜環(huán),通常是吡啶或者嘧啶,常與鉸鏈區(qū)Gln530或Cys532發(fā)生氫鍵作用;中心的咪唑環(huán)占據(jù)ATP結(jié)合口袋,環(huán)C取代芳基與變構(gòu)位點(diǎn)相互作用,芳香環(huán)D引入極性基團(tuán)伸向溶劑區(qū)(見圖1),代表化合物SB-590885(8)。據(jù)報(bào)道,化合物8對(duì)BRAF的Kd值為0.3 nM,可見其酶抑制活性非常高[9]。

    圖1 三芳基咪唑類BRAF抑制劑及與BRAF結(jié)合模式

    Dan等[10]對(duì)8進(jìn)行改造,將C環(huán)的肟改成帶氫鍵供體的吡唑,設(shè)計(jì)出化合物9,并以9為先導(dǎo)物進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化,將D環(huán)取代基環(huán)合成甲基哌嗪得到活性更加的10,其抑制BRAFV600E的IC50為240 nM。2013年,Dan[11]等又將C環(huán)換成萘酚得到脂溶性和活性更佳的化合物11(抑制BRAF的IC50=9nM)。

    2.1.4噻吩類化合物 Xie等[12]利用分子對(duì)接和結(jié)構(gòu)虛擬篩選(SBVS)技術(shù)成功從SPECS數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到一系列噻吩類BRAFV600E選擇性抑制劑,其中化合物12和13抑制BRAFV600E的IC50達(dá)到微摩爾級(jí),可作為先導(dǎo)物來(lái)進(jìn)一步改造。

    2.2 II型抑制劑 II型抑制劑與BRAF的Type II構(gòu)象結(jié)合,通過2~5個(gè)氫鍵占據(jù)疏水口袋中的變構(gòu)位點(diǎn)。其中最重要的兩個(gè)氫鍵分別是與αC-helix中保守的Glu側(cè)鏈形成的氫鍵和與DFG基序中Asp形成的氫鍵。而這個(gè)疏水口袋周圍的氨基酸保守性較差,因此II型抑制劑可能具有更好的選擇性。

    2.2.1 Sorafenib (BAY 43-9006,14)

    Sorafenib是首個(gè)成功上市的Raf激酶抑制劑,盡管后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)抗腫瘤活性主要是通過多種受體酪氨酸激酶(RTK),包括VEGFR、PDGFR和kit等抑制腫瘤組織內(nèi)新生血管的生成;但它作為第一個(gè)BRAF抑制劑,臨床前研究表明,它對(duì)BRAFWT和BRAFV600E都有很好的激酶抑制活性。蛋白晶體復(fù)合物揭示,Sorafenib與激酶Type II結(jié)合,屬于II型抑制劑,它的吡啶環(huán)上酰胺基與鉸鏈區(qū)Cys531形成氫鍵促使吡啶環(huán)占據(jù)ATP結(jié)合口袋;脲基片段與Glu500和Asp593形成三個(gè)氫鍵,穩(wěn)定住BRAF的非活性構(gòu)象;末端的三氟甲基占據(jù)αC helix和DFG基序的末端N殘基構(gòu)成的疏水口袋。通過上述結(jié)合作用Sorafenib使BRAF激酶不能磷酸化,從而抑制激酶活性。基于Sorafenib結(jié)構(gòu)柔性較大,后續(xù)研究者采用骨架躍遷來(lái)降低分子的柔性。

    2.2.2 RAF265(17) Savithri等[13]將Sorafenib的脲基分別與A、B芳環(huán)拼合得到化合物15和16,雖然兩者的BRAF抑制活性略有下降,但理化性質(zhì)和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)都有所提高。因此,以16為先導(dǎo)物進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到活性較好的RAF265(17)。在人類移植瘤研究中,RAF265對(duì)BRAFV600E人移植瘤和BRAFWT模型都具有高效性,目前正處于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的二期臨床實(shí)驗(yàn)階段。

    2.2.3吡啶并咪唑酮類化合物 Niculescu-Duvaz等[14]將Sorafenib末端酰胺與C環(huán)吡啶駢合成吡啶并咪唑酮,并在A環(huán)中去除4-Cl,加上6-甲氧基得到化合物18。初步活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明,化合物18抑制BRAF激酶的IC50達(dá)到12nM,抑制黑色素瘤生長(zhǎng)的 IC50為4.2 μmol·L-1。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化將B環(huán)換成萘環(huán)以占據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn)旁的親脂性口袋,最后得到酶(IC50=6nM)和細(xì)胞(IC50=0.32μmol·L-1)抑制活性都更佳的化合物19。

    2.2.4噻吩并吡啶類化合物 Tang等[15]用4-氨基噻吩并吡啶替換C環(huán)得到化合物20和21,活性篩選顯示其抑制BRAF的IC50分別為9.6和5.1nM,抑制黑色素瘤的 IC50為0.7和0.2μmol·L-1。

    3結(jié)論

    BRAF抑制劑能靶向性抑制MAPK信號(hào)通路中的BRAF激酶,上市藥物有Sorafenib、Vemurafenib和Dabrafenib,臨床用于黑色素瘤的治療。但這些藥物仍面臨諸多挑戰(zhàn),例如Sorafenib存在靶點(diǎn)特異性不強(qiáng),BRAF的基因突變?cè)斐蒝emurafenib和Dabrafenib臨床中都出現(xiàn)耐藥性,因而迫切需要開發(fā)新型特異性耐突變BRAF特別是BRAFV600E抑制劑。借助于BRAF三維晶體結(jié)構(gòu)的解析和計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)的進(jìn)步,將會(huì)有越來(lái)越多結(jié)構(gòu)新穎、特異性強(qiáng)、耐突變的BRAF抑制劑被研究開發(fā)出來(lái),用于黑色素瘤、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等腫瘤疾病治療。

    參考文獻(xiàn):

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    編輯/申磊

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