基于ENO基因的豬附紅細(xì)胞體病PCR-ELISA檢測方法的建立

相思宇， 倪婷婷， 薛書江

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

豬附紅細(xì)胞體病是由豬附紅細(xì)胞體(Mycoplasmasuis)引起的一種以貧血、發(fā)熱和黃疸為主要臨床癥狀的傳染病[1-2]。豬患病后可分為急性感染和慢性感染2種，該病具有較高的隱性感染率，常和其他疾病混合感染，使該病的臨床診斷難度增加，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。因此，建立一種特異性高、靈敏度強(qiáng)的檢測方法，對豬附紅細(xì)胞體病的診斷和防治具有重要意義。

目前，豬附紅細(xì)胞體病的診斷方法主要有直接鏡檢法(姬姆薩染色法，瑞氏染色法、丫啶橙染色法、電鏡法)[6-8]、血清學(xué)診斷法(ELISA法)[8-10]、分子生物學(xué)診斷方法(DNA雜交技術(shù)法、PCR技術(shù)法、半套式PCR技術(shù)法)[11-12]和PCR-ELISA法[13-14]。其中，前3種方法雖然在附紅細(xì)胞體病診斷方面得到了大量的應(yīng)用，但3種方法均易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。而PCR-ELISA方法是一種將PCR擴(kuò)增與ELISA檢測相結(jié)合的技術(shù)，由Niemeyer等于1997年創(chuàng)建[15]。PCR-ELISA方法與前幾種方法相比具有更高的敏感性和特異性，該技術(shù)不僅提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性，還有效避免了常規(guī)方法中容易錯判的假陽性和假陰性結(jié)果。該方法已在病毒、微生物、寄生蟲的檢測以及腫瘤治療等領(lǐng)域被普遍應(yīng)用[15-17]。如2005年，Scotter等用實(shí)時熒光定量PCR法與PCR-ELISA法對侵入性曲霉感染的檢測進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示PCR-ELISA較實(shí)時熒光定量PCR具有更高的敏感性[18]。

雖然PCR-ELISA方法在寄生蟲早期診斷方面得到了應(yīng)用，但目前關(guān)于豬附紅細(xì)胞體病的PCR-ELISA診斷方法較少。該試驗(yàn)根據(jù)GenBank上公布的豬附紅細(xì)胞體ENO基因序列設(shè)計合成引物，旨在建立適用于豬附紅細(xì)胞體病的診斷及流行病學(xué)調(diào)查的PCR-ELISA檢測方法，從而為豬附紅細(xì)胞體病的防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

豬血液樣本采自吉林省延吉市某豬場。豬附紅細(xì)胞體、豬鏈球菌、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、弓形蟲以及健康豬血清均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。DNA Marker、ExTaqDNA聚合酶、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體、TMB顯色液均購自大連寶生物工程有限公司；鏈霉親和素、鮭魚精DNA均購自上海生工生物股份有限公司；血液DNA提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA生物公司。

1.2 PCR擴(kuò)增以及PCR擴(kuò)增條件的篩選

根據(jù)Genbank中豬附紅細(xì)胞體 ENO基因(CP002525.1)，用Oligo6.0軟件設(shè)計1對引物，并在上、下游引物的5′端分別標(biāo)記生物素(BIOT)和地高辛(DIG)。(p1)：5′-BIOT-AGGGATACCGCATCAAGACAC-3′;(p2)：5′-DIG-TCATCGGAACCGACGTAAACT-3′。以豬附紅細(xì)胞體陽性DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μLPCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，ExTaqDNA 聚合酶 0.3 μL，上、下游引物各 1.5 μL，dd H2O 16.2 μL，dNTP 1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，設(shè)置退火溫度梯度從50～60 ℃：50.0 ℃、50.7 ℃、51.9 ℃、53.7 ℃、56.1 ℃、58.0 ℃、59.2 ℃和60.0 ℃，72 ℃ 45 s，共25個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶亮度選擇最佳退火溫度。以豬附紅細(xì)胞體陽性DNA為模板，選擇15、20、25、30、35個循環(huán)，同時選擇10、30、50、100、300倍稀釋PCR產(chǎn)物。測各孔OD630nm值，確定最佳循環(huán)數(shù)以及PCR產(chǎn)物稀釋倍數(shù)。

1.3 PCR-ELISA檢測步驟

將PBS用鏈霉親和素稀釋后，100 μL/孔，4 ℃條件下包被過夜。甩去液體并拍干，用200 μL/孔的PBST洗板，并拍干，重復(fù)3次后。加入封閉液200 μL/孔，封閉2 h，洗板拍干后加入PCR產(chǎn)物按1∶30稀釋，100 μL/孔，37 ℃固定1 h。PBST洗板后拍干加入1∶2 000倍稀釋的抗地高辛抗體,37 ℃作用1 h，洗板拍干后加入TMB顯色液100 μL/孔，37 ℃避光放置10 min，用酶標(biāo)儀測定OD630nm值。

1.4 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

在相同反應(yīng)條件下，篩選鏈霉親和素包被液(50 mmol/L pH值9.6碳酸鹽緩沖液、40 mmol/L pH值6.8 Tris-HCL緩沖液以及40 mmol/L pH值8.8 Tris-HCL緩沖液)，選擇碳酸鹽緩沖溶液進(jìn)行包被，對鏈霉親和素包被濃度(10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL)和HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體稀釋度(1∶1 000～1∶5 000)做方陣滴定。對封閉液魚精DNA濃度(0.25、0.5、1.00、2.00 mg/mL)和封閉時間(30、60、120 min)進(jìn)行篩選優(yōu)化，根據(jù)以上優(yōu)化的最佳條件。在37 ℃條件下，選擇顯色液作用10、15、20、25 min時測定各孔OD630nm值。

1.5 PCR-ELISA臨界值的確定

1.6 PCR-ELISA的特異性試驗(yàn)

對豬附紅細(xì)胞體、豬鏈球菌、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、弓形蟲及健康豬血的DNA，按所建立的PCR-ELISA方法進(jìn)行檢測，評價其特異性。

1.7 PCR-ELISA敏感性試驗(yàn)

將豬附紅細(xì)胞體陽性DNA基因用去離子水進(jìn)行梯度稀釋，得到1.77×1011、1.77×1010、1.77×109、1.77×108、1.77×107、1.77×106和1.77×105拷貝/μL的一系列梯度濃度，按照最佳條件進(jìn)行常規(guī)PCR及PCR-ELISA試驗(yàn)，比較二者敏感性并分析敏感性與DNA濃度的關(guān)系。

1.8 PCR-ELISA的重復(fù)性試驗(yàn)

選擇同一批次包被的以及不同批次包被的酶標(biāo)板，對4份豬附紅細(xì)胞體PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行批內(nèi)以及批間重復(fù)性試驗(yàn)。每份樣品重復(fù)5次測定OD630nm值，計算變異系數(shù)，以評估該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣本檢測

用本試驗(yàn)所建立的PCR-ELISA方法以及夏曉輝[16]建立的PCR-ELISA方法，對采自延吉市某豬場的40份豬血液樣本進(jìn)行檢測，以比較二者的敏感性，并計算二者符合率。

1.10 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，檢測差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及其擴(kuò)增條件的篩選結(jié)果

以豬附紅細(xì)胞體陽性DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件參照1.2步驟進(jìn)行。結(jié)果得到大小約為170 bp的條帶，與預(yù)期ENO基因片段大小相符(圖1)。PCR擴(kuò)增條件的篩選結(jié)果，58 ℃為最佳退火溫度。PCR循環(huán)數(shù)和稀釋倍數(shù)篩選結(jié)果顯示，最佳循環(huán)數(shù)為25，PCR產(chǎn)物的最佳稀釋倍數(shù)為1∶30。

注：M.DL 2 000vDNA Marker;1.ENO gene;2.Negative control

2.2 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

對ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果顯示，最佳包被液為pH 9.6碳酸鹽緩沖液；鏈酶親和素最適濃度為5 μg/mL；抗地高辛抗體最佳稀釋倍數(shù)為1∶2 000；鮭魚精DNA最適濃度為1 mg/mL，封閉時間為37 ℃下反應(yīng)2 h；最佳顯色時間為15 min。

2.3 PCR-ELISA臨界值的確定

在最佳條件下對30份豬附紅細(xì)胞體陰性樣本進(jìn)行PCR-ELISA檢測。根據(jù)SPSS軟件計算得到平均值x=0.138，標(biāo)準(zhǔn)方差SD=0.018，由公式臨界值=平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)方差，求得陰性與陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)OD630nm值為0.192。OD630nm≥0.192為陽性，反之則為陰性。

2.4 PCR-ELISA特異性試驗(yàn)

利用本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA方法對豬附紅細(xì)胞體、豬鏈球菌、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、弓形蟲及健康的豬血基因DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示本試驗(yàn)所建立的方法僅對豬附紅細(xì)胞體檢測為陽性，對其他病原體表現(xiàn)為陰性(表1)，表明本試驗(yàn)具有良好的特異性。

表1 PCR-ELISA特異性試驗(yàn)

注：“+”為陽性；“-”為陰性。

2.5 PCR-ELISA敏感性檢測

用本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA對濃度分別為33、3.3、0.33 ng/μL和33、3.3、0.33 pg/μL及33 fg/μL的豬附紅細(xì)胞體DNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示PCR-ELISA可檢測出樣本的最低濃度為0.33 pg/μL(表2)，而常規(guī)PCR檢測方法可檢測的模板最低濃度為3.3 pg/μL。表明該試驗(yàn)建立的PCR-ELISA的敏感性較高，且比常規(guī)PCR高約10倍。

表2 PCR-ELISA敏感性檢測結(jié)果

2.6 PCR-ELISA重復(fù)性檢測

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，5份樣品的變異系數(shù)為2.59%～6.17%，5份樣本變異系數(shù)均低于10%，說明建立的PCR-ELISA1檢測方法的批內(nèi)重復(fù)性良好(表3)。

表3 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)(OD630nm)

批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，5份樣品的變異系數(shù)為3.45%～7.39%，變異系數(shù)均低于10%，說明建立的PCR-ELISA檢測方法批間重復(fù)性良好(表4)。

表4 批間重復(fù)性試驗(yàn)(OD630nm)

2.7 臨床樣本檢測

對40份血液樣品應(yīng)用本試驗(yàn)所建立的PCR-ELISA方法與夏曉輝建立的PCR-ELISA方法進(jìn)行對比試驗(yàn)。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所建立的PCR-ELISA檢測出9份陽性樣品，檢出率為22.5%(9/40)，利用夏曉輝建立的PCR-ELISA方法檢測出7份陽性樣品，檢出率為17.5%(7/40)，結(jié)果證明該試驗(yàn)建立的PCR-ELISA方法陽性檢出率更高，二者的符合率為95%(表5)。

表5 臨床樣本檢測結(jié)果

注：PCR-ELISA-1為夏曉輝建立的PCR-ELISA方法；PCR-ELISA-2為本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA方法。

3 討論與結(jié)論

豬附紅細(xì)胞體病目前沒有較穩(wěn)定統(tǒng)一的診斷方法，因此，建立一種適合于臨床準(zhǔn)確診斷該病的檢測方法，對該病的控制以及預(yù)防具有重要意義。國內(nèi)外學(xué)者對豬附紅細(xì)胞體的檢測方法進(jìn)行了大量研究。目前豬附紅細(xì)胞體病的檢測主要以傳統(tǒng)檢測方法為主，這些方法易產(chǎn)生假陽性和假陰性的結(jié)果，不適用于臨床大批量檢測豬附紅細(xì)胞體病。Niemeyer等于1997年創(chuàng)建了PCR-ELISA技術(shù)，該方法具有所需試驗(yàn)儀器要求低、材料低廉、操作簡便、特異性強(qiáng)、敏感性高、不易產(chǎn)生假陽性和假陰性等特點(diǎn)，適合大批量檢測[13]。如2005年，Scotter等用實(shí)時熒光定量 PCR法與PCR-ELISA法對侵入性曲霉感染的檢測進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示PCR-ELISA較 實(shí)時熒光定量 PCR具有更高的敏感性[18]。PCR-ELISA 技術(shù)利用逐級放大生物信號，具有敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外研究表明，PCR-ELISA方法與傳統(tǒng)方法相比較，敏感性提高了10～100倍[19]

2013年，夏曉輝等用豬附紅細(xì)胞體OxaA基因成功建立了PCR-ELISA檢測方法，結(jié)果顯示建立的PCR-ELISA方法具有敏感、特異、安全和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)[14]。而本試驗(yàn)則選擇2011年GenBank上最新公布的ENO基因建立附紅細(xì)胞體的PCR-ELISA檢測方法。ENO作為發(fā)現(xiàn)的第3個豬附紅細(xì)胞體的特異性基因，其表達(dá)蛋白是一種特異性更強(qiáng)的蛋白并具有很好的免疫原性，但目前還未建立該基因的PCR-ELISA診斷方法。因此，本試驗(yàn)選擇該基因建立PCR-ELISA檢測方法，對于豬附紅細(xì)胞體的臨床診斷具有重要意義。

本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA方法與夏曉輝建立的PCR-ELISA方法相比較，優(yōu)化了豬附紅細(xì)胞體PCR-ELISA反應(yīng)條件，簡化了操作步驟，節(jié)省了操作時間，提高了檢測的靈敏度。敏感性檢測結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立方法的檢測濃度為1.77×106拷貝/μL的陽性DNA，與夏曉輝建立的方法檢測最低濃度1.93×106拷貝/μL的陽性DNA比較，本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA方法敏感性更高。對批內(nèi)及批間的重復(fù)性進(jìn)行檢測，變異系數(shù)均低于10%，證明本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA方法具有很好的穩(wěn)定性。對40份臨床血液進(jìn)行PCR-ELISA檢測，本試驗(yàn)方法陽性檢出率為22.5%(9/40)，夏曉輝建立的PCR-ELISA方法陽性檢出率為17.5%(7/40)，且二者的符合率為95%，由此證明，本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA方法對臨床樣本檢測的靈敏度更高。

此外，本試驗(yàn)建立PCR-ELISA方法的目的主要是在于通過對試驗(yàn)條件的篩選，建立一種敏感性更高，適合臨床檢測的試驗(yàn)方法。由于該方法是建立在PCR基礎(chǔ)上，因此對PCR的循環(huán)數(shù)及PCR產(chǎn)物的濃度進(jìn)行篩選至關(guān)重要[20]。試驗(yàn)結(jié)果證明，在25個循環(huán)時檢測結(jié)果最好，擴(kuò)增效率達(dá)到了峰值，25個循環(huán)后擴(kuò)增效率進(jìn)入平臺期，因此確定25循環(huán)為最佳的循環(huán)數(shù)。而PCR產(chǎn)物的濃度則選擇30倍稀釋，原因在于30倍稀釋時的OD值較對照組差異更加明顯，并且高濃度的PCR產(chǎn)物有利于縮短固定時間。

本試驗(yàn)基于ENO基因所建立的豬附紅細(xì)胞體PCR-ELISA檢測方法具有強(qiáng)的敏感性及特異性，易于臨床應(yīng)用。