基于納米材料的適配體生物傳感器在真菌毒素檢測中的應(yīng)用研究進展

田 靜， 孫文怡， 黃寶璽， 郭志軍

(1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600； 3.安圖縣市場監(jiān)督管理局，吉林 安圖 133600)

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的具有毒性的次生代謝產(chǎn)物，常見的真菌毒素有黃曲霉毒素(aflatoxin, AF)，赭曲霉毒素(ochratoxin)，伏馬菌素(Fumonisins, F)，串珠鐮刀菌素(Moniliformin, MF)，玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)等[1-2]。真菌毒素通過被污染的谷物和飼料進入食物鏈，長期攝入會引起人類和動物的急性或慢性中毒，對人畜表現(xiàn)出致癌性和遺傳毒性、致畸性、免疫抑制等[3-4]。近年來，由真菌毒素引起的食品安全問題在世界范圍內(nèi)日益突出，嚴重威脅人類健康和生命安全。

在食品中最為常見的是黃曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素(OTA)，現(xiàn)已被世界衛(wèi)生組織(WHO)國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)列為致癌污染物[5-6]。在大量關(guān)于真菌毒素爆發(fā)的報告中，最令人震驚的是2004年報告的肯尼亞125人因AFB1中毒導致死亡。考慮到真菌毒素的潛在威脅，有許多分析方法被開發(fā)用于測定各種基質(zhì)中的真菌毒素，包括液相色譜(LC)，薄層色譜(TLC)，高效液相色譜(HPLC)，免疫親和層析(IAC)，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和電化學免疫傳感器等[7-10]。但是這些方法普遍具有一定的局限性，比如樣品前處理復雜，檢測周期長，成本高，需要大型儀器和專業(yè)的操作人員等[11]。如今，隨著技術(shù)的發(fā)展和檢測的需要已經(jīng)出現(xiàn)了更多簡單而經(jīng)濟的方法。

1 納米材料

納米材料(nanometermaterial)是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1～100 nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，在分析化學、材料化學、電化學和生物化學等領(lǐng)域都有著重要應(yīng)用[12-13]。納米材料具有獨特的磁性、光學和導電特性等，可以提高檢測的高靈敏度，降低檢測限(LOD)[14]。因此，納米材料被廣泛應(yīng)用于適配體生物傳感器中，用作標記物或信號增強劑，具有增強信號和放大信號的作用[15]。常用納米材料的優(yōu)點見表1。

表1 不同納米材料的優(yōu)點

2 核酸適配體

核酸適配體(Aptamer)簡稱適配體，是通過指數(shù)富集(SELEX)進化技術(shù)從寡核苷酸序列庫中篩選獲得的對靶物質(zhì)具有高親和力的單鏈寡核苷酸片段[22]。與抗體一樣，適配體與靶分子具有特異性識別結(jié)合的能力，因此被稱為“化學抗體”。與抗體相比，適配體具有更多優(yōu)點，如更小的尺寸，更好的組織穿透，更高的熱穩(wěn)定性，更低的免疫原性，更容易生產(chǎn)，更低的合成成本，易修飾等[23]。適配體作為一段寡核苷酸片段本身不具備信號轉(zhuǎn)換功能，因此，目標分析物與適配體識別結(jié)合后，需通過換能器將識別信息轉(zhuǎn)變成可定量處理的信號，最終檢測出待測物濃度[24]。

3 適配體生物傳感器及其在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

生物傳感器是指以生物分子(DNA，真菌毒素抗體，酶，微生物，細胞，組織等)為敏感元件，經(jīng)分子識別后發(fā)生生物學反應(yīng)，產(chǎn)生的信號被相應(yīng)的物理或化學換能器轉(zhuǎn)變成可定量處理的電化學、光學、電磁學等信號，再經(jīng)2次放大輸出，便可知道待測分析樣品的濃度[25-26]。生物傳感器檢測原理示意圖如圖1所示。

Sample tobeanalysed-待測分析樣品；Moleculary recognizing biomaterials-分子識別生物材料；Signal transducer-信號換能器；Detectable signal-檢測信號。

圖1 生物傳感器的檢測原理示意圖

Fig.1 Schematic diagram of the detection principle of the biosensor

根據(jù)檢測信號的不同，核酸適配體傳感器主要分為比色適配體傳感器、熒光適配體傳感器、電化學適配體傳感器、表面增強拉曼光譜適配體傳感器等，本文基于納米材料構(gòu)建的適配體傳感器為研究對象，通過不同的檢測信號，對4種適配體傳感器在真菌毒素檢測方面的應(yīng)用進行綜述[27-28]。表2歸納了近5年基于納米材料檢測食品中真菌毒素的生物傳感器的檢測方法。

表2 食品中真菌毒素的生物傳感器檢測方法

3.1 基于納米材料的比色信號適配體生物傳感器在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

比色信號檢測是一種用肉眼就能看出顏色變化的分析方法，具有簡單、快速、用肉眼就可以實現(xiàn)半定量檢測的優(yōu)點。目前，金銀納米材料是比色法最常用的顯色納米材料。曾憲冬等人[42]采用金納米粒子作為比色探針，適配體為識別元件，建立了快速檢測赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)的比色適配體傳感器。首先，將作為連接鏈的OTA 適配體與其互補的DNA 鏈進行雜交，使功能化的金納米粒子發(fā)生聚集。當溶液中加入OTA 時，OTA與適配體結(jié)合，從而使適配體鏈與互補的 DNA鏈發(fā)生解鏈，團聚的金納米粒子由于靜電作用重新分散于溶液中，顏色由藍紫色變成紅色。沒有OTA加入時，顏色不變。欒云霞等[43]人使用納米金在鹽的誘導下凝聚后發(fā)生顏色變化，建立一種基于納米金和單鏈DNA適配體檢測AFB1的簡單可行的檢測方法。納米金是一種膠體溶液，在高濃度 NaCl 的作用下凝聚產(chǎn)生顏色變化。當AFB1存在于溶液中時，適配體單鏈DNA特異性地與AFB1結(jié)合，形成特定的三維立體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能抵抗納米金的吸附。表面沒有吸附單鏈DNA的納米金在加入高濃度鹽后凝聚, 溶液變?yōu)樗{色。當AFB1不存在于溶液中時，適配體暴露的正電荷與納米金表面的負電荷發(fā)生靜電作用而直接吸附到納米金表面，吸附有單鏈適配體的納米金在高鹽濃度下保持分散，溶液顏色不變，仍為紅色。因此，可利用分光光度計對溶液進行吸光度測定，即可建立吸光度與OTA濃度之間的線性關(guān)系，實現(xiàn)比色信號檢測OTA。

3.2 基于納米材料的熒光信號適配體生物傳感器在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

熒光信號檢測法具有靈敏度高、檢測限低、測定時間短等優(yōu)點，因此基于熒光信號的適配體傳感器受到廣泛關(guān)注。Zhijun Guo等[44]人利用單壁碳納米管(SWNTs)作為淬滅劑，構(gòu)建了一種適用于OTA檢測的熒光適配體傳感器。其原理是在不存在靶分子(OTA)的情況下，適配體呈游離單鏈DNA狀態(tài)，易被SWNTs吸附，適配體上標記的羧基熒光素(FAM)易被SWNTs通過能量共振轉(zhuǎn)移而淬滅。在靶分子(OTA)存在情況下，適配體與OTA特異性識別結(jié)合，形成G-quadruplex二級結(jié)構(gòu)， G-quadruplex結(jié)構(gòu)能抵抗SWNTs的吸附，適配體上標記的熒光信號得以保留。因此，可以通過測定不同OTA濃度對應(yīng)的熒光強度建立濃度與熒光強度的關(guān)系進行OTA檢測，最終檢測限為24.1 nM。Jing Zhang等[45]人報道了基于DNA支架和銀納米簇(DNA/AgNCs)作為信號平臺的熒光適配體傳感器，用于同時檢測OTA和AFB1。將OTA適配體(Ap1)和AFB1適配體(Ap2)分別固定在磁珠MBs表面上再加入信號探針1(Sp1)和信號探針2(Sp2)進行雜交，形成Aps-Sps雙鏈體結(jié)構(gòu)。在存在這2種真菌毒素的情況下，它們與各自相應(yīng)的Apt結(jié)合形成G-四鏈體的復合結(jié)構(gòu)，Sp1和Sp2被釋放。通過磁分離，上清液中的Sps作為相應(yīng)的支架，與加入的AgNCs結(jié)合產(chǎn)生不同的熒光發(fā)射峰。隨后，在DNA/AgNCs合成期間，向溶液中加入Zn(II)離子，使熒光強度增加更易于觀察，其OTA和AFB1的線性范圍為0.001～0.05 ng/mL，檢測限OTA為0.2 pg/mL，AFB1為0.3 pg/mL。Zhisong Lu等[46]人開發(fā)了一種基于二硫化鉬(MoS2)納米片與半導體量子點(QDs)結(jié)合作為有效熒光淬滅劑(QDs-MoS2)和新型適配體-CDTe 用于檢測OTA。當存在OTA時，適配體-QDs結(jié)構(gòu)可以與OTA特異性結(jié)合形成折疊的四鏈體結(jié)構(gòu)。并且OTA分子占據(jù)的核堿基被埋在結(jié)構(gòu)內(nèi)，適配體-QDs結(jié)構(gòu)和MoS2納米片之間的相互作用力變得非常弱，所以QDs熒光被保留。當不存在OTA時，適配體-QDs結(jié)構(gòu)和MoS2納米片相互作用，導致QDs熒光被MoS2納米片淬滅。因此，通過熒光強度檢測OTA的含量。該平臺顯示出良好的特異性，檢測限為1.0 ng/mL。

3.3 基于納米材料的電化學信號適配體生物傳感器在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

電化學信號檢測方法具有選擇性高、簡便、成本低并且檢測更加精密的優(yōu)點。電化學適配體傳感器是將靶分子與適配體特異性結(jié)合的識別信號轉(zhuǎn)換為電化學信號，通過電流或電位的變化來檢測目標分子，納米材料的加入使其檢測更加靈敏快速。Seyed Hamid Jalalian等[39]人基于金納米顆粒(AuNPs)和黃曲霉毒素M1(AFM1)適配體(Apt)以及適配體互補鏈(CS)，構(gòu)建了一種新型電化學適配體傳感器用于AFM1的檢測。Apt發(fā)夾結(jié)構(gòu)在沒有靶分子(AFM1)的情況下，CS修飾的AuNPs不會與金電極表面上的Apt結(jié)合，其原理是基于CS靶向誘導Apt和AuNPs的偶聯(lián)。在AFM1存在的情況下，Apt發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開并形成Apt/AFM1復合結(jié)構(gòu)。因此，Apt的5′端暴露出來與固定在AuNPs表面上的CS雜交。為了增加傳感平臺的靈敏度加入較少量的亞甲基藍(加入的亞甲基藍作為氧化還原劑導致帶正電荷的亞甲基藍與帶負電荷的AuNPs和雙鏈DNA之間發(fā)生靜電相互作用)。在電極表面上富集的高濃度亞甲基藍產(chǎn)生強電化學信號。另一方面，在沒有AFM1的情況下，Apt會保留其發(fā)夾結(jié)構(gòu)。因此，CS修飾的AuNPs不能與Apt結(jié)合，導致在電極表面上亞甲基藍濃度較低，因此，只有微弱的電化學信號。該體系檢測限為0.9 ng/L，并且成功應(yīng)用于實際樣品如牛奶和血清的檢測。Rijian Mo等[47]人提出了一種基于氧化石墨烯(GO)修飾的聚丙烯酸(PAA)膜通過π-π堆積與AFB1的適配體結(jié)合用于檢測AFB1的新型生物傳感器。簡而言之，通過共價鍵將適配體固定在PAA膜的納米通道表面上，然后加入氧化石墨烯與適配體結(jié)合。通過引入帶負電的氧化石墨烯和適配體，PAA納米通道的負電荷增加，引起空間位阻。在添加AFB1時，AFB1與適配體特異性結(jié)合，氧化石墨烯從納米通道的表面脫離，電荷密度和空間位阻減少，導致加入的Fe(CN)63-通過納米通道的量增加，使電流響應(yīng)增加。電流的增加與AFB1的濃度成正比，檢測限約0.13 ng/mL，線性范圍為1～20 ng/mL。此外，該傳感器對AFB1具有良好的選擇性。Yonghong Wang[38]開發(fā)了基于金納米粒子和β-環(huán)糊精修飾的MoS2納米片(MoS2-AuNPs-β-CD)的電化學適配體傳感器用于OTA超靈敏檢測。首先，通過β-環(huán)糊精(β-CD)主體-客體識別，在適配體末端用亞甲基藍(MB)修飾過后固定在金電極的表面上，然后將MoS2納米片/AuNPs納米復合材料作為信號放大平臺。當存在OTA時，MB-適配體的結(jié)構(gòu)從垂直線性轉(zhuǎn)變?yōu)镚-四鏈體，其自身不能接近電極表面導致MB-適配體的氧化還原電流降低，而游離的二茂鐵羧酸可識別并占據(jù)空位在電流中產(chǎn)生信號。在此基礎(chǔ)上，對OTA進行了高靈敏度檢測，OTA濃度對傳感器信號的線性響應(yīng)范圍在0.1～50 nM，并且最低檢測限為0.06 nM。該檢測的方法易構(gòu)建，具有高靈敏度和特異性。K. Yugender Goud等[36]人使用氧化石墨烯(GO)和亞甲基藍(MB)氧化還原探針標記的適配體作為信號放大平臺，開發(fā)出一種電化學適配體傳感器，用于檢測AFB1。將官能化的氧化石墨烯固定在碳電極(SPCE)上，然后使用六亞甲基二胺(HMDA)作為間隔物，通過碳二亞胺酰胺鍵將MB標記的適配體固定在SPCE上。當與目標靶分子AFB1相互作用時，適配體結(jié)構(gòu)的雙鏈體形式會轉(zhuǎn)換為G-四鏈體形式，接近電極表面并進行快速電子轉(zhuǎn)移。增加目標分析物的濃度四鏈體結(jié)構(gòu)也會增加，隨后，越來越多被MB標記的適配體更接近電極表面，導致電化學信號增加。在此設(shè)計中，氧化石墨烯層增加了傳感器系統(tǒng)的導電和催化特性，有助于提高電化學信號對目標分析物識別的靈敏度。其AFB1的線性響應(yīng)范圍為0.05～6.0 ng/mL，檢測限低至0.05 ng/mL，且顯示出優(yōu)良的選擇特異性。

3.4 基于納米材料的拉曼信號適配體生物傳感器在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

拉曼信號檢測具有對樣品無接觸，無損傷、快速分析、靈敏度高的優(yōu)點。拉曼信號適配體傳感器是一種化學和生物檢測的有效分析方法。Erdene-Ochir Ganbold等[48]人報道了一種基于銀納米顆粒(AgNPs)和Cy5染料標記的OTA適配體的表面增強拉曼散射(SERS)傳感器測定OTA。當不存在OTA時，適配體可以容易地吸附在銀納米顆粒(AgNPs)的表面上并產(chǎn)生強的SERS信號。在0.1～10 nM濃度范圍內(nèi)加入OTA時，由于OTA與適配體結(jié)合，適配體不能吸附到AgNPs表面，因此SERS信號減少了40%。使用基于SERS的方法實現(xiàn)了OTA的納摩爾檢測。Mingxiu Yang等[49]人基于納米晶體(GDADNTs)和氨基末端適配體綴合的磁珠(CS-Fe3O4)構(gòu)建了一種新型的SERS適配體傳感器，用于痕量檢測AFB1。氨基末端適配體綴合的磁珠(CS-Fe3O4)和納米晶體(GDADNTs)分別用作AFB1的捕獲劑和傳導劑。CS-Fe3O4作為捕獲納米探針，用于捕獲靶標(AFB1)和富集SERS活性底物；GDADNTs作為報告納米探針，用于增強和表達AFB1的拉曼信號。這樣，報告探針和捕獲探針將通過適配體的特異性連接形成檢測平臺，當AFB1存在時，GDADNTs與CS-Fe3O4和AFB1的適配體特異性結(jié)合，在磁分離后會顯示明顯的拉曼信號。當不存在AFB1時，GDADNTs不會與CS-Fe3O4聚集在一起，經(jīng)過磁分離后，沒有拉曼信號產(chǎn)生。Aike Li等[41]人首次制作了基于金納米星(AuNS)與核-銀納米粒子(AgNP)的SERS傳感器，用于檢測AFB1。使用AFB1適配體(DNA1)修飾的AgNP粒子和互補序列(DNA2)修飾的AuNS粒子構(gòu)建了SERS傳感器。當AFB1適配體(DNA1)修飾的Ag粒子和互補序列(DNA2)修飾的Au粒子結(jié)合，SERS信號得到增強。當AFB1存在時，Ag粒子表面上的AFB1適配體將與靶標結(jié)合，Ag粒子被移除并且SERS信號減少。當AFB1不存在時，適配體無靶標結(jié)合，因此不會影響SERS信號。該SERS傳感器對AFB1顯示出極高的特異性，線性檢測范圍為1～1 000 pg/mL，檢測限為0.48 pg/mL，使用花生奶的試驗表明該傳感器可用于實際樣品檢測。Quansheng Chen等[40]人基于Au和Ag核/殼納米棒，將氨基末端AFB1適配體(NH2-DNA1)連接到磁珠(CS-Fe3O4)上作為富集納米探針，巰基末端互補適配體(SH-DNA2)連接到AuNR @ DNTB @ Ag納米棒(ADANRs)作為報告納米探針，通過適配體和互補序列之間的雜交反應(yīng)制備NH2-DNA1-CS-Fe3O4和SH-DNA2-ADANR來進行AFB1的檢測。DNTB(二硫代二硝基苯甲酸)因其具有較大拉曼散射截面且無熒光干擾，作為拉曼報告分子嵌入Au和Ag核/殼納米棒中。當存在AFB1時，AFB1將與NH2-DNA1-CS-Fe3O4競爭性結(jié)合，誘導SH-DNA2-ADANR與CS-Fe3O4的解離并進一步降低SERS信號。當不存在AFB1時，CS-Fe3O4與ADANRs表面修飾的NH2-DNA1與SH-DNA2結(jié)合形成復合物，即可收集到SERS信號。檢測限為0.003 6 ng/mL。

以上4種適配體傳感器應(yīng)用相對廣泛，一些其他傳感器在檢測真菌毒素方面報道相對較少，因為所需材料復雜，靈敏度較差，程序繁瑣，成本較高等一系列因素限制了其檢測體系的開發(fā)。納米材料因具有良好的特性，被廣泛應(yīng)用于適配體生物傳感器的開發(fā)，在檢測真菌毒素方面具有良好的應(yīng)用前景。

4 展望

真菌毒素極大威脅人類健康和生命安全，如今隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們對食品安全更加重視。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，生物傳感器成為一種高新技術(shù)在醫(yī)學、軍事、食品、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域均得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用，也為我們的生產(chǎn)生活帶來了很大的方便。生物傳感器的開發(fā)可以檢測痕量的真菌毒素，并且具有耗時短、成本低、易操作等一系列優(yōu)點，非常適用于食品安全緊急事件的現(xiàn)場快速檢測和風險預警。但在真菌毒素的檢測中也存在一些問題，如實際樣品基質(zhì)的復雜性，給檢測的準確性帶來一定難度；核酸適配體生物傳感器中適配體篩選過程比較繁瑣、沒有針對任何靶標的統(tǒng)一篩選程序的標準，因此核酸適配體的穩(wěn)定性還需進一步加強。在未來的發(fā)展中應(yīng)優(yōu)化生物傳感器技術(shù)的檢測性能，即優(yōu)化它們的檢測限、響應(yīng)時間和特異性，致力于研發(fā)快速化、微型化、自動化的新型生物傳感器。隨著研究的深入，適配體與納米材料的結(jié)合使得比色、熒光、電化學、拉曼等各類生物傳感器的構(gòu)建更加多元和便捷，因此，基于納米材料的生物傳感器的應(yīng)用將變得更加廣泛。相信隨著分析方法及檢測手段的進一步發(fā)展，生物傳感器技術(shù)必將給人們的生活帶來巨大的變化，并且在食品安全檢測領(lǐng)域也將發(fā)揮越來越重要的作用。