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    均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化人參單芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基

    2019-09-02 07:43:38陳雙越包悅琳金東淳
    關(guān)鍵詞:瓊脂生根人參

    陳雙越, 包悅琳, 陳 鴿, 李 昂, 金東淳

    (延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 1330021)

    人參具有重要的醫(yī)療保健價(jià)值和巨大的經(jīng)濟(jì)效益,自古以來就被人們視為珍品[1-3]。但是人參的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)少、常異花授粉等生物學(xué)特性嚴(yán)重制約著品種選育進(jìn)程,同時(shí)也是基礎(chǔ)性研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它植物的主要原因[4]。利用組織培養(yǎng)方法,建立高效、穩(wěn)定的人參再生植株體系是克服這些不利因素,加快新品種選育進(jìn)程,提高基礎(chǔ)研究水平的有效途徑[5-7]。然而,人參的常規(guī)組織培養(yǎng)同樣存在難度大、發(fā)根難、再生植株頻率低等諸多問題[8-9]。鑒于人參繁殖及育種的難題,國(guó)內(nèi)外研究人員試圖通過生物技術(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)擺脫人參生產(chǎn)及育種上的困境[10]。如通過建立人參的組織快速培養(yǎng)體系,大量繁殖人參苗來緩解生產(chǎn)上的需求,或在組培體系基礎(chǔ)上利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的品種進(jìn)行改良,亦或通過調(diào)控光、溫、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等來促使試管苗開花結(jié)實(shí)來縮短其育種周期等[11-14]。雖然已有很多關(guān)于人參組織培養(yǎng)方面的報(bào)道,但尚未見有穩(wěn)定的體系在育種及生產(chǎn)上應(yīng)用,因此有必要建立一套有效的人參組培體系,以期為人參育種的后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)[15-18]。

    長(zhǎng)期以來,國(guó)內(nèi)外針對(duì)建立完整的人參組織培養(yǎng)體系做了大量研究[19]。雖然已經(jīng)有一些關(guān)于人參組培體系建立的報(bào)告,其中提到的各種激素濃度為人參組培的進(jìn)一步研究提供了參考[20-22]。但目前發(fā)現(xiàn)的報(bào)告中,大多是采用單因素研究方法,這種方法有可能會(huì)漏掉一些較優(yōu)的組合。而使用均勻設(shè)計(jì)恰好能規(guī)避這個(gè)弊端,既能夠保證試驗(yàn)的均勻性和準(zhǔn)確性,又能大大減少試驗(yàn)次數(shù),且目前尚未有采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化人參組織培養(yǎng)中各激素配比的相關(guān)報(bào)道[23]。

    本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基,大田生長(zhǎng)的人參葉片為試材,采用均勻設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)不同氮濃度、不同種類的激素組合,探討并篩選了人參葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基,以期建立高效、穩(wěn)定的人參再生植株體系,為后續(xù)育種試驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    采集試驗(yàn)田的人參葉片,將采集的人參葉片放在水流中清洗,以除去表面污垢。再將人參葉片放入滅菌后的燒杯中,在無菌條件下用75%乙醇浸泡30 s,將其取出用無菌水沖洗2次,每次5 min。然后將葉片浸入0.1%升汞溶液中,浸泡6 min,并不斷晃動(dòng)燒杯,之后用無菌水洗滌3次,每次5 min,最后用無菌水浸泡以備用。

    1.2 方法

    1.2.1 人參葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

    在無菌條件下將備好的人參葉片用刀切成小塊,用鑷子將愈傷組織接種在2,4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 0.66 mg/L+1%瓊脂,pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中,并設(shè)置培養(yǎng)溫度為25 ℃。

    1.2.2 人參不定芽的誘導(dǎo)

    將帶有愈傷組織的人參葉片接種在IBA 3 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 3 mg/L+1%瓊脂,pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中,然后置于光照時(shí)長(zhǎng)為16 h/d,溫度為25 ℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

    1.2.3 誘導(dǎo)生根

    將帶有不定芽的愈傷組織切成單芽并以MS為基本培養(yǎng)基,附加瓊脂8 g/L,pH值為5.8。將NO3-、NH4+與NAA、KT、IBA、6-BA、IAA、GA36種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,參照均勻設(shè)計(jì)U15(158),設(shè)計(jì)8個(gè)因素,每種因素為15水平(表1),每處理10瓶,每瓶1枚外植體。30 d后統(tǒng)計(jì)人參單芽生根數(shù),生根后的根粗、根長(zhǎng)、莖粗、莖長(zhǎng)。通過分析得到最佳激素組合后,在添加有最佳激素組合的培養(yǎng)基中接種人參帶有愈傷組織的單芽進(jìn)行驗(yàn)證。

    表1 人參單芽U15(158)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.2.4 移栽

    打開已經(jīng)生根的試管瓶進(jìn)行煉苗,煉苗的必備條件是溫度25 ℃,5 000~10 000 lx的光照強(qiáng)度,時(shí)間為4~6 d。當(dāng)有小的菌落剛剛出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面時(shí),及時(shí)地將試管苗從試管瓶中移出。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同處理對(duì)單芽生根率的影響

    接種后,每7 d觀察1次單芽生根情況,28 d時(shí)統(tǒng)計(jì)單芽生根的誘導(dǎo)情況。通過觀察培養(yǎng)14 d后開始有根出現(xiàn)。28 d后統(tǒng)計(jì)各處理單芽生根率(圖1)。由表2可知,7號(hào)處理的單芽生根率最高,為90%,其次為11號(hào)50%,5號(hào)40%,3號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)都為30%,10號(hào)、12號(hào)、14號(hào)都為20%,4號(hào)、13號(hào)都為10%,而1號(hào)、2號(hào)、15號(hào)處理的單芽沒有生根。

    表2 單芽生根率

    2.2 不同處理對(duì)單芽地上部的影響

    28 d后統(tǒng)計(jì)各處理單芽地上部情況(表3)。由表3可知,8號(hào)處理莖粗增長(zhǎng)值最大,為0.04 cm,其次為3號(hào)、5號(hào)6號(hào)、7號(hào)、12號(hào),都為0.03 cm,1號(hào)、10號(hào)、15號(hào)都為0.02 cm,2號(hào)、4號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、13號(hào)、14號(hào)都為0.01 cm。7號(hào)處理莖長(zhǎng)增長(zhǎng)值最大,為0.17 cm,其次為8號(hào)0.13 cm,3號(hào)、6號(hào)、12號(hào)都為0.11 cm,4號(hào)、11號(hào)都為0.06 cm,13號(hào)0.05 cm,1號(hào)0.04 cm,15號(hào)0.03 cm,5號(hào)、10號(hào)、14號(hào)都為0.02 cm,2號(hào)、9號(hào)都為0.01 cm。

    表3 單芽地上部試驗(yàn)結(jié)果

    2.3 不同處理對(duì)單芽地下部的影響

    28 d后統(tǒng)計(jì)各處理單芽地下部情況(表4)。

    表4 單芽地下部試驗(yàn)結(jié)果

    由表4可知,7號(hào)處理根粗增長(zhǎng)值最大,為0.32 cm,其次為14號(hào)0.28 cm,10號(hào)0.26 cm,3號(hào)0.24 cm,5號(hào)、8號(hào)都為0.22 cm,12號(hào)0.20 cm,9號(hào)0.18 cm,11號(hào)0.15 cm,13號(hào)0.08 cm,6號(hào)0.06 cm,4號(hào)0.02 cm,1號(hào)、2號(hào)、15號(hào)都為0。7號(hào)處理根長(zhǎng)增長(zhǎng)值最大為1.03 cm,其次為14號(hào)0.89 cm,5號(hào)0.83 cm,3號(hào)0.78 cm,10號(hào)0.76 cm,8號(hào)、12號(hào)都為0.66 cm,11號(hào)0.33 cm,13號(hào)0.27 cm,4號(hào)、9號(hào)都為0.24 cm,6號(hào)0.20 cm,1號(hào)、2號(hào)、15號(hào)都為0。

    2.4 偏最小二乘回歸建模分析結(jié)果

    使用DPS中的偏最小二乘回歸分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,參考PRESS統(tǒng)計(jì)量以及誤差統(tǒng)計(jì)量的下降趨勢(shì),選擇5個(gè)潛變量個(gè)數(shù),建立二次多項(xiàng)式回歸模型,得到各因子與5個(gè)指標(biāo)間的主效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)。其中,NH4+(X2),NAA(X3),IBA(X5),6BA(X6)和GA3(X8)對(duì)單芽生根率(Y1),生根后莖粗的增長(zhǎng)值(Y2),生根后莖長(zhǎng)的增長(zhǎng)值(Y3),生根后根粗增長(zhǎng)值(Y4)和生根后根長(zhǎng)增長(zhǎng)值(Y5)的影響為正效應(yīng),NO3-(X1),KT(X4)及IAA(X5)對(duì)單芽生根率(Y1),生根后莖粗的增長(zhǎng)值(Y2),生根后莖長(zhǎng)的增長(zhǎng)值(Y3),生根后根粗增長(zhǎng)值(Y4)和生根后根長(zhǎng)增長(zhǎng)值(Y5)的影響為負(fù)效應(yīng)。

    由表5可知,提取不同潛變量個(gè)數(shù)增加時(shí),標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)模型誤差平方和及PRESS統(tǒng)計(jì)量呈下降趨勢(shì),且潛變量個(gè)數(shù)為5時(shí),Y1、Y2、Y3、Y4、Y5的誤差平方和分別為0.048 7,0.047 6,0.046 7,0.048 0,0.047 0,小于0.05,表明分析具有顯著性,相應(yīng)的決定系數(shù)分別為0.928 5,0.831 4,0.858 9,0.894 9,0.880 7,說明潛變量對(duì)因變量的解釋能力很強(qiáng),回歸模型的擬合效果較好(決定系數(shù)R2接近1,說明潛變量對(duì)因變量的解釋能力越強(qiáng),回歸模型擬合效果越好)。

    在DPS軟件中設(shè)定需要的優(yōu)化條件為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5取最大值,對(duì)以上5個(gè)模型進(jìn)行優(yōu)化,得到各因素的最優(yōu)值:當(dāng)X1(NO3-)為3 mg/L,X2(NH4+)為7 mg/L,X3(NAA)為0.1 mg/L,X4(KT)為0.1 mg/L,X5(IBA)為8 mg/L,X6(6-BA)為0.125 mg/L,X7(IAA)為0.15 mg/L,X8(GA3)為6 mg/L時(shí),有最優(yōu)目標(biāo)函數(shù)值,其中,Y1=96%,Y2=0.13 cm,Y3=0.07 cm,Y4=0.32 cm,Y5=1.02 cm。

    表5 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的模型誤差平方和及決定系數(shù)

    2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

    在添加最佳激素組合的培養(yǎng)基中接種人參單芽,30 d后生根誘導(dǎo)率達(dá)95%,生根后莖粗的增長(zhǎng)值為0.09 cm,生根后莖長(zhǎng)的增長(zhǎng)值為0.07 cm,生根后根粗增長(zhǎng)值為0.32 cm,生根后根長(zhǎng)增長(zhǎng)值為1.03 cm。,與模型預(yù)測(cè)值十分接近,表明由模型預(yù)測(cè)出的最佳激素組合符合實(shí)際操作中人參根誘導(dǎo)的要求,結(jié)果比較滿意。

    3 討論與結(jié)論

    均勻設(shè)計(jì)是方開泰等為了解決多因素、多水平高科技難題而提出的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)。基于試驗(yàn)點(diǎn)在整個(gè)試驗(yàn)范圍內(nèi)是均勻散布的,從均勻性角度出發(fā),大大減少了試驗(yàn)次數(shù),并且分析準(zhǔn)確性好;能從全面試驗(yàn)點(diǎn)中挑選出部分代表性的試驗(yàn)點(diǎn),這些試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)充分均衡分散,但仍能反映體系的主要特征。它與其它試驗(yàn)設(shè)計(jì)法的最大不同之處就在于能從盡可能少的試驗(yàn)次數(shù)中揭示出因素對(duì)指標(biāo)的影響大小和規(guī)律,能夠以最少的次數(shù),從多個(gè)因素中找出影響試驗(yàn)結(jié)果的各因素的主次和最優(yōu)結(jié)果,并且可以進(jìn)行優(yōu)化擬合設(shè)計(jì)[23]。而本研究是通過均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化了人參單芽誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基。

    由于人參的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)少、常異花授粉等生物學(xué)特性嚴(yán)重制約品種選育進(jìn)程。因而雖然栽培人參的系統(tǒng)選育工作己經(jīng)開展了幾十年,育種工作者也積極進(jìn)行了新品種的選育工作,但育成品種卻很少,而組織培養(yǎng)作為一種快速創(chuàng)造新種質(zhì)的方法,能在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)品質(zhì)優(yōu)良的單株進(jìn)行擴(kuò)增,因此利用組織培養(yǎng)方法是克服這些不利因素,加快人參新品種選育進(jìn)程,提高基礎(chǔ)研究水平的有效途徑。然而,至今為止,人參組織培養(yǎng)仍然存在難度大、發(fā)根難、再生植株頻率低等諸多問題。

    本研究通過均勻設(shè)計(jì)篩選出了誘導(dǎo)人參根的最佳培養(yǎng)基為NO3-3 mg/L+NH4+7 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L+IBA 8mg/L+6-BA 0.125 mg/L+IAA 0.15 mg/L+GA36 mg/L+8%瓊脂+3%蔗糖,其根的誘導(dǎo)率達(dá)95%。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已篩選出誘導(dǎo)人參愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 0.66 mg/L+1%瓊脂,誘導(dǎo)率為93%和誘導(dǎo)人參不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+IBA 3 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 3 mg/L+1%瓊脂,誘導(dǎo)率為86%。因此,本實(shí)驗(yàn)室已基本建立了較完整的人參組培體系,對(duì)加快人參新品種選育進(jìn)程,提高人參基礎(chǔ)研究水平等諸方面具有重要意義。

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