水楊酸對(duì)東北刺人參黃酮和蒽醌積累的影響

田 文， 郝悅君， 孫浩丁， 安曉麗， 樸炫春， 廉美蘭

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

東北刺人參(OplopanaxelatusNakai)又稱刺參，五加科多年生落葉灌木，國家二級(jí)保護(hù)植物，全世界只有中國、俄羅斯和朝鮮3國境內(nèi)有少量分布[1]。其干燥根和莖均可入藥，是一種珍稀的藥用植物，具有多種生物活性物質(zhì)，主要有揮發(fā)油、黃酮類、蒽醌類、脂肪酸、多糖以及多種皂苷等[2]，常用來治療神經(jīng)衰弱、低血壓和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥[3]。但是由于其人工栽培技術(shù)尚不成熟，無法滿足市場需要，導(dǎo)致其野生資源遭到大量采伐，物種瀕臨滅絕。為改善東北刺人參資源現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)室利用生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了其不定根的培養(yǎng)[4-7]，但是由于一些條件因素尚未探明，導(dǎo)致培養(yǎng)的不定根有效物質(zhì)含量較低，因此，仍需進(jìn)一步研究以提高不定根有效物質(zhì)含量。

黃酮類物質(zhì)是植物的重要次生代謝產(chǎn)物之一，具有純天然、高活性、見效快、作用廣泛等特點(diǎn)，是極具開發(fā)前景的天然抗氧化劑，能有效減少和清除自由基，具有延緩人體衰老、防治疾病的作用[8-10]。蒽醌類物質(zhì)常存在于植物的代謝產(chǎn)物中，具有止血、抗菌、瀉下、利尿的作用[11-12]。研究表明，東北刺人參內(nèi)含有多種黃酮類與蒽醌類物質(zhì)[13]，因此，在利用生物反應(yīng)器進(jìn)行東北刺人參不定根培養(yǎng)時(shí)，為獲得較高的黃酮類和蒽醌類物質(zhì)，本研究以添加外源誘導(dǎo)子等方式，提高其積累量。

外源施加誘導(dǎo)子可以有效提高植物次生代謝產(chǎn)量[14]，其中SA是一種在植物組織培養(yǎng)中常用的誘導(dǎo)子[15]。目前研究表明，SA是一種重要的的內(nèi)源信號(hào)分子，能夠激活植物過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性[16]。王博等[17]利用濃度為50～150 μmol/L的SA處理霍山石斛類原球莖，可顯著促進(jìn)多糖的合成，并且SA最佳處理濃度為100 μmol/L，培養(yǎng)18 d時(shí)，多糖產(chǎn)量提高了1.63倍；妮細(xì)爐等[18]用不同濃度SA處理魚腥草幼苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度(50 μg/mL)的SA能增加魚腥草幼苗的槲皮素。因此，試驗(yàn)利用SA處理東北刺人參不定根，探明SA處理濃度和處理時(shí)間對(duì)不定根中黃酮類和蒽醌類物質(zhì)含量的影響，為東北刺人參不定根的資源利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

參照于丹等[7]的方法誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)東北刺人參不定根。將增殖培養(yǎng)的不定根切成約1 cm后，稱取20 g接種于含有4 L培養(yǎng)基的5 L氣球型氣升式生物反應(yīng)器中。培養(yǎng)基為MS+3 mg/L IBA+50 g/L糖，pH值為5.8，通氣量75 mg/L，在溫度為25 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。將反應(yīng)器培養(yǎng)30 d的不定根作為本研究的試驗(yàn)材料。

利用2種黃酮類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品和3種蒽醌類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品分別制成混合標(biāo)準(zhǔn)品用于HPLC測定。黃酮類和蒽醌類物質(zhì)結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 黃酮類物質(zhì)及蒽醌類物質(zhì)單體結(jié)構(gòu)圖

1.2 方法

1.2.1 SA處理濃度對(duì)東北刺人參不定根黃酮和蒽醌含量的影響

分別收集反應(yīng)器內(nèi)的不定根與培養(yǎng)基。在150 mL三角瓶中加入100 mL收集的培養(yǎng)基后，分別加入經(jīng)濾膜(0.22 μm)過濾除菌的不同濃度的SA(0、90、100、110和120 μmol/L)。各誘導(dǎo)子處理的培養(yǎng)瓶中，接入12.5 g不定根后，將培養(yǎng)瓶置于120 r/min振蕩器上(GTCS-2013B，金壇市科析儀器有限公司，中國)，在溫度為25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)。8 d后利用高效液相色譜(HPLC)測定不定根中黃酮類(槲皮素、山奈素)和蒽醌類物質(zhì)(蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素)含量。

1.2 2 SA處理時(shí)間對(duì)東北刺人參不定根黃酮和蒽醌含量的影響

分別收集反應(yīng)器內(nèi)的不定根與培養(yǎng)基。在150 mL三角瓶中加入100 mL收集的培養(yǎng)基后，加入經(jīng)濾膜(0.22 μm)過濾除菌的100 μmol/L SA。誘導(dǎo)子處理的培養(yǎng)瓶中，接入12.5 g不定根后，將培養(yǎng)瓶放置于120 r/min的振蕩器上，在溫度為25 ℃的黑暗條件下分別培養(yǎng)6、7、8、9和10 d后收獲不定根，并測定不定根中黃酮類和蒽醌類物質(zhì)的含量。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1) 黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精確取1.4 mg槲皮素和0.6 mg山奈素標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解于1 mL色譜甲醇中，待標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解后各吸取0.5 mL置于5 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容，配成濃度分別為0.14和0.06 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。將1 mL黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別稀釋5、10、20、50和100倍，進(jìn)行HPLC檢測。

2) 蒽醌類標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精確稱取0.4 mg蘆薈大黃素、0.3 mg大黃酸和0.6 mg大黃素標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶解于1 mL甲醇和三氯甲烷以9∶1混合的溶液中,待完全溶解后各吸取0.5 mL于5 mL的容量瓶中，用色譜甲醇定容，配制濃度分別為0.04、0.03和0.06 mg/mL的混合溶液。將1 mL蒽醌類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別稀釋5、10、20、50和100倍，進(jìn)行HPLC檢測。

1.2.3.2 黃酮類和蒽醌類物質(zhì)含量的測定

參照楊浩[19]和Hossain等[20]的方法。將東北刺人參不定根研磨成粉末，并過80目篩，稱取1 g粉末，置于250 mL蒸餾燒瓶中，加入50 mL 80%甲醇溶液(含5%鹽酸)，80 ℃回流提取1 h，過濾后收集濾液，于60℃下減壓濃縮，乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相于60 ℃下減壓揮干，甲醇定容至5 mL后，用0.45 μm濾膜過濾，既得待測樣品。

1) 黃酮類物質(zhì)測定條件：槲皮素和山荼素均采用366 nm波長下檢測，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為甲醇與1%磷酸水溶液，流速0.8 mg/mL，柱溫30 ℃。

2) 蒽醌類物質(zhì)測定條件：蘆薈大黃素、大黃酸及大黃素檢測波長254 nm，流動(dòng)相0.1% (v·v-1)的磷酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～40 min，80% B,流速1.0 mg/L，柱溫30 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析及軟件處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，利用Graphpad prism 7軟件程序，數(shù)據(jù)的對(duì)比分析使用鄧肯氏新復(fù)極差法，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA濃度對(duì)東北刺人參黃酮和蒽醌類物質(zhì)含量的影響

隨著SA濃度的增加，不定根中槲皮素的含量呈先上升后下降的趨勢，并且在100 μmol/L時(shí)，槲皮素含量達(dá)到最高，為121.57 μg/g(圖2 A)。山奈素的含量變化趨勢與槲皮素相同，也在100 μmol/L時(shí)達(dá)到最高，為110.27 μg/g(圖2 B)。隨著SA濃度的增加，蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素的含量也是先增加后減少，其中,在100 μmol/L時(shí)，3者含量最高，分別為56.04、302.86和97.55 μg/g(圖3)。

圖2 SA處理濃度對(duì)東北刺人參黃酮類物質(zhì)含量的影響

圖3 SA處理濃度對(duì)東北刺人參蒽醌類物質(zhì)含量的影響

2.2 SA處理時(shí)間對(duì)東北刺人參黃酮和蒽醌類物質(zhì)含量的影響

隨著SA的處理時(shí)間增加，不定根中槲皮素、山萘素的含量先增加后減少，在處理8 d時(shí)，槲皮素和山奈素含量均達(dá)到最高值，分別為134.99和117.06 μg/g(圖4)。不定根中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素的含量也是隨著SA處理時(shí)間的增加呈先增加后減少的趨勢，在處理8 d時(shí)，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素的含量達(dá)到最高值，分別為70.41、737.05和105.70 μg/g(圖5)。

圖4 SA處理時(shí)間對(duì)東北刺人參黃酮類物質(zhì)含量的影響

圖5 SA處理時(shí)間對(duì)東北刺人參蒽醌類物質(zhì)含量的影響

3 討論與結(jié)論

植物不定根培養(yǎng)技術(shù)作為一種植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)手段，具有生長周期短、可人為調(diào)控生長條件、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于瀕危藥用植物資源開發(fā)利用等領(lǐng)域[21]，東北刺人參作為一種珍稀藥用植物，其不定根的生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)被相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者報(bào)道[5]，該技術(shù)為解決東北刺人參資源緊缺的問題提供了方向，但是目前關(guān)于東北刺人參的黃酮類和蒽醌類物質(zhì)生產(chǎn)的研究較少，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的不定根有效物質(zhì)含量較低，導(dǎo)致生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)無法應(yīng)用于東北刺人參產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)，阻礙了其工業(yè)化應(yīng)用。

SA在植物抵御和適應(yīng)外界不良環(huán)境條件過程中發(fā)揮著重要作用，它能夠改變相關(guān)防御基因的表達(dá)水平，使得某些次生代謝產(chǎn)物的累積水平發(fā)生改變。本研究在東北刺人參不定根培養(yǎng)30 d后，用不同濃度的水楊酸處理，并測定了不定根中黃酮類與蒽醌類物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，SA處理能夠提高東北刺人參不定根中黃酮類物質(zhì)的含量，當(dāng)處理濃度在100 μmol/L時(shí)，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根中黃酮類物質(zhì)槲皮素與山奈素的含量達(dá)到最大值，分別為121.57和110.26 μg/g，分別是對(duì)照組的2.6與1.5倍；SA的處理時(shí)間為8 d時(shí)，不定根中黃酮類物質(zhì)中槲皮素、山萘素的含量達(dá)到最高值，分別為134.99和117.06 μg/g，分別是對(duì)照組的2.0和1.7倍。譚玲玲等[18]用50 ug/mL SA處理后的魚腥草槲皮素含量提高了近5倍，Wee等[22]研究發(fā)現(xiàn),添加一定濃度SA后，體外培養(yǎng)的守宮木的代謝產(chǎn)物山奈素較對(duì)照組提高了10.2倍，這些研究結(jié)果與本次研究結(jié)果均表明，誘導(dǎo)子水楊酸能夠提高體外培養(yǎng)植物組織內(nèi)的黃酮類物質(zhì)含量。

對(duì)于不定根中蒽醌類物質(zhì)如蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素的含量，當(dāng)SA處理濃度為100 μmol/L時(shí)，含量達(dá)到最高，分別為56.04、302.86和97.55 μg/g，分別是對(duì)照組的1.5、1.1和1.5倍。而對(duì)于處理時(shí)間的影響，當(dāng)處理時(shí)間為8 d時(shí)，不定根中蒽醌類物質(zhì)含量達(dá)到最高，分別為70.41、737.05和105.7 μg/g，且分別是對(duì)照組的2.0、2.9與2.1倍。Thiruvengadam等[23]的研究也表明，在進(jìn)行何首烏體外細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，通過外源添加SA，能夠使其中的蒽醌類物質(zhì)如大黃素，大黃素甲醚等提高數(shù)倍，張志強(qiáng)等[24]的研究也證明SA能夠提高海巴戟天懸浮細(xì)胞中的蒽醌類物質(zhì)含量，且是對(duì)照組的1.18倍，這些研究與本次研究均表明，外源施加一定濃度SA處理一定的時(shí)間，能夠促進(jìn)離體培養(yǎng)組織中的蒽醌類物質(zhì)的含量。

綜上所述，適宜的水楊酸處理對(duì)東刺刺人參不定根有效物質(zhì)合成具有促進(jìn)作用，在培養(yǎng)第30天時(shí)，SA處理濃度為100 μmol/L并處理8 d，可有效提高東北刺人參不定根中黃酮和蒽醌類物質(zhì)的含量。