甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用研究進(jìn)展

王款 陳澤田 潘韻 白靜文 梁子豪 鄭文官 李莉玲

摘 要：甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬生防菌的新成員，具有抗逆性強(qiáng)、抗菌譜廣、環(huán)境友好且不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，在倡導(dǎo)綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的時(shí)代背景下，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌及其制劑將具有非常廣闊的發(fā)展前景。本文主要從甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物、作用機(jī)理及在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用論述其研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌;代謝產(chǎn)物;作用機(jī)理;應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190730013

農(nóng)作物病害防治一直是困擾世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的難題，一直以來化學(xué)農(nóng)藥的大量使用給農(nóng)作物病害防治帶來了極大的便利且取得了顯著效果，但隨之而來的負(fù)面效應(yīng)如病原菌耐藥性的增強(qiáng)、環(huán)境污染、大量農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，也讓人越來越難以接受，因此，綠色、無殘留、無公害的生物防治方法應(yīng)運(yùn)而生。生防菌作為農(nóng)作物病害防治的有益菌，由于其能夠代謝產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)抑制作物病原菌的生長(zhǎng)并競(jìng)生為優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)還能改善土壤環(huán)境，且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，近年來受到越來越多的關(guān)注。

目前，細(xì)菌、真菌、放線菌作為生防菌在生物防治中均有應(yīng)用。其中，芽孢桿菌屬作為生防菌中的佼佼者，已有多種芽孢桿菌被研究應(yīng)用于農(nóng)作物病害防治，穆常青等[1]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B-332菌株對(duì)稻瘟病具有良好的防治效果，紀(jì)兆林等[2]研究地衣芽孢桿菌對(duì)蘋果輪紋病菌和炭疽病菌具有較強(qiáng)的防治效果，陸燕等[3]研究解淀粉芽孢桿菌41B-1對(duì)花生白絹病具有良好的防治效果;甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌 （Bacillus methylotrophicus） 是Munusamy Madhaiyan等人2010年報(bào)道的新種，作為芽孢桿菌屬的一員，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌作為生防菌的研究越來越多，其在農(nóng)作物病害生物防治領(lǐng)域正扮演著越來越重要的角色。本文主要從甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的抑菌代謝產(chǎn)物、作用機(jī)理及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 抑菌代謝產(chǎn)物

生防菌之所以能起到防治農(nóng)作物病害的作用，主要?dú)w功于其自身生長(zhǎng)繁殖所產(chǎn)生的一種或多種抑菌代謝產(chǎn)物，這些抑菌代謝產(chǎn)物起到了類似抗生素的作用，往往具有廣譜抗菌性。張龍來[4]等研究解淀粉芽孢桿菌HN011對(duì)多種病害的病原真菌具有明顯的拮抗作用，如香蕉枯萎病、番茄莖腐根腐病、菜心炭疽病、水稻稻瘟病、水稻紋枯病，經(jīng)大量理化分析證明其發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物主要是一些環(huán)二肽;孫啟利等[5]研究地衣芽孢桿菌W10對(duì)油菜菌核病具有較強(qiáng)的防治效果，經(jīng)分析其抑菌代謝產(chǎn)物為W10抗菌蛋白。

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌代謝產(chǎn)物多樣，經(jīng)研究具有抑菌能力的代謝產(chǎn)物主要有抗菌蛋白、抗菌肽、蛋白酶、纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶、嗜鐵素等，目前被報(bào)道的一些甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌抗菌試驗(yàn)中，這些代謝產(chǎn)物中的幾種通常能夠被同時(shí)檢測(cè)出來，說明甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌可以從不同的途徑對(duì)相應(yīng)病原菌進(jìn)行抑制。采俊香[6]等對(duì)抱莖苦荬菜內(nèi)生甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌G-5抗菌蛋白抗真菌特性進(jìn)行研究，其對(duì)番茄早疫病病菌、梨黑斑病病菌和番茄灰霉病病菌均具有較好抑菌效果，抑菌率分別為88.3%、90.5%和95.4%;王洪梅[7]等從土壤中篩選出一株對(duì)番茄青枯病病原菌具有較強(qiáng)抑制效果的菌株N5，經(jīng)鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，通過大量理化分析實(shí)驗(yàn)，證明其起到抑菌效果的代謝產(chǎn)物為鐵載體、β-1，3-葡聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶及多種脂肽類物質(zhì)。呂倩[8]等從南海深海海泥中采集的88個(gè)細(xì)菌樣品中分離出一株具有較強(qiáng)抗真菌活性的細(xì)菌SHB114，鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，其對(duì)黃瓜炭疽病菌、立枯絲核菌、黃瓜枯萎病菌等植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制活性。對(duì)其抗真菌活性物質(zhì)跟蹤檢測(cè)，分離純化得到3個(gè)脂肽類化合物，經(jīng)鑒定均為bacillomycin Lc類脂肽。

2 作用機(jī)理

2.1 競(jìng)爭(zhēng)作用

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬生防菌，其主要競(jìng)爭(zhēng)作用為營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)。營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)如在產(chǎn)生嗜鐵素的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌中，其代謝產(chǎn)生的嗜鐵素可與病原菌競(jìng)爭(zhēng)土壤中的Fe3+，由于鐵元素是微生物生長(zhǎng)必不可少的微量元素，因而能起到抑制病原菌生長(zhǎng)的作用[9];位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)是指其通過在植物根際、體表或體內(nèi)的定殖和繁衍占據(jù)有利靶位，來降低病原微生物侵染的機(jī)會(huì)。

2.2 拮抗作用

拮抗作用主要是甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌通過產(chǎn)生各種抑菌代謝產(chǎn)物，來抑制植物病原菌生長(zhǎng)或直接將其殺死，目前以抗菌肽、蛋白酶和纖維素酶的拮抗機(jī)制研究最為常見。

2.2.1 抗菌肽

抗菌肽是一種廣泛存在于細(xì)菌、真菌、無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、植物乃至人類中的天然小分子抗菌物質(zhì)[10]，由于其具有廣譜抗菌活性且不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，近年來在植物病害生防領(lǐng)域受到越來越多的研究?？咕耐ǔв幸欢康碾姾?，具有兩親性，按其結(jié)構(gòu)一般可以分為以下幾種： α-螺旋、β -片層、環(huán)狀結(jié)構(gòu)[11]、無規(guī)卷曲[11]、復(fù)合結(jié)構(gòu)[11]。根據(jù)目前的研究，一般認(rèn)為其抑制或殺死病原菌的作用機(jī)理主要有2種，通過自身特殊的分子結(jié)構(gòu)作用于細(xì)胞膜，通過破壞胞膜的完整性并形成離子通道，造成細(xì)胞內(nèi)容物外溢、胞外水分大量?jī)?nèi)流使細(xì)胞不能維持正常的滲透壓而死亡，這一過程目前發(fā)現(xiàn)的有4種作用類型，分別是桶板模型、毯式模型、環(huán)孔模型和凝聚模型[12];作用于病原菌胞內(nèi)靶點(diǎn)，如抑制核苷酸、蛋白質(zhì)的合成等。

2.2.2 蛋白酶、纖維素酶和β-1，3-葡聚糖酶

植物病原真菌細(xì)胞壁一般是由幾丁質(zhì)、β-1，3-葡聚糖、纖維素和少量的蛋白質(zhì)組成，因此部分甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶、纖維素酶和β-1，3-葡聚糖酶可以作用于病原真菌細(xì)胞壁，造成其細(xì)胞壁的溶解而死亡。

2.3? 誘導(dǎo)抗性

植物在受到外源物質(zhì)誘導(dǎo)后，會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列信號(hào)傳導(dǎo)和物質(zhì)代謝變化，如自身防御酶水平和活性顯著增高，抗病機(jī)制得到增強(qiáng)。李桐[13]在甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌NJ13對(duì)人參銹腐病的生防作用研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過NJ13菌株誘導(dǎo)的人參苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶3種防御酶基因，在接種后不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均較無菌水對(duì)照組有不同程度的提高。

3 應(yīng)用

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌自2010年被首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道以來，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)其生物特性進(jìn)行了大量的研究和開發(fā)，目前，其在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、食品加工、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用研究均有報(bào)道。作為生防菌芽孢桿菌屬的新成員，其在農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域已然成為一顆冉冉升起的新星。

由灰葡萄孢菌 （灰霉菌） Botrytis cinerea 引起的灰霉病是世界范圍內(nèi)危害最為嚴(yán)重的真菌性病害，能夠侵染包括番茄 Solanum lycopersicum、黃瓜 Cucumis sativus Linn、葡萄 Vitis spp.、草莓 Fragaria ananassa Duch 等蔬菜在內(nèi)的200多種植物[14]。魏新艷、黃媛媛等[15]從464株海洋細(xì)菌中分離出一株具有較強(qiáng)拮抗灰霉菌作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BH21，其具有產(chǎn)生多種抗菌脂肽的能力，發(fā)酵液脂肽粗提物對(duì)葡萄灰霉病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，在葡萄灰霉病生物防治中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

我國(guó)是世界上幾個(gè)最大的棉花主產(chǎn)地之一，但每年由大麗輪枝菌 （Verticillium dahliae Kleb.） 引起的黃萎病對(duì)棉花生產(chǎn)造成了大量的損失，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)20%～60%。陳麗華等[16]從棉花植株上分離篩選出一株對(duì)大麗輪枝菌具有較強(qiáng)拮抗作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LH-L3，經(jīng)過室內(nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)證明，菌株LH-L3具有較好的促生長(zhǎng)和棉花黃萎病防治的效果，具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用潛力。

西瓜枯萎病是由西瓜枯萎尖孢鐮刀菌引起的一種頑固性土傳病害，發(fā)病率高，造成西瓜秧苗萎蔫壞死，嚴(yán)重影響西瓜產(chǎn)量和質(zhì)量。殷曉敏[17]等從西瓜枯萎病重病園區(qū)中長(zhǎng)勢(shì)良好的西瓜根際分離獲得一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌XG-1，其對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)具有良好抑制效果;田間小區(qū)實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)XG-1菌液灌根處理的瓜苗植株發(fā)病率顯著降低。

王全[18]等采用對(duì)峙法篩選得到一株對(duì)白菜黑斑病菌 Alternaria brassicae 具有強(qiáng)烈拮抗作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LBC-2，田間防治試驗(yàn)表明，LBC-2菌劑的病指防效達(dá)到79.08%，對(duì)白菜黑斑病具有一定的防治作用。

謝學(xué)文[19]等從連作多年的黃瓜根際土樣中篩選得到一株對(duì)黃瓜炭疽病菌 Colletotrichum orbiculare 具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株WF-3，2a的田間試驗(yàn)表明菌株WF-3培養(yǎng)物對(duì)黃瓜炭疽病具有良好的防治效果，防效分別達(dá)到68.14%和73.7%。

胡江春等從遼寧渤海海域的海泥樣品中篩選出一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BAC-9912，其產(chǎn)生的脂肽類化合物等代謝產(chǎn)物對(duì)灰霉菌病原菌 Botrytis cinerea 具有很強(qiáng)的抑菌活性，且安全無公害。多年的田間試驗(yàn)證明BAC-9912對(duì)黃瓜、番茄的灰霉、晚疫病，棉花黃枯萎病及蘋果樹腐爛病均具有顯著防效，是一種綠色、新型、高效的生物殺菌劑。2015年12月31日，農(nóng)業(yè)部藥檢所公示華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌9912母藥和可濕性粉劑在我國(guó)首獲登記。母藥含量為40億芽孢/g，毒性微毒;制劑含量為30億芽孢/g，劑型為可濕性粉劑，毒性微毒，噴霧用于防治黃瓜灰霉病，制劑用藥量937.5～1，500g/hm2。

4 問題與展望

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上的生防應(yīng)用研究主要還停留在“室內(nèi)”開發(fā)、試驗(yàn)階段，考慮到生防菌在大田植物根際、體內(nèi)或體表的定殖和繁衍是其防控植物病害的基礎(chǔ)，因此在選育優(yōu)良抗病菌株的基礎(chǔ)上，要根據(jù)菌株自身生長(zhǎng)特性，并結(jié)合田間環(huán)境因素，通過適當(dāng)?shù)奈锢?、化學(xué)、生物等技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行改良，增強(qiáng)其田間定殖能力。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌能夠產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，但拮抗菌株發(fā)揮抗菌作用的具體代謝產(chǎn)物種類及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

由于傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)業(yè)在給人們帶來便利和高效的同時(shí)也造成了嚴(yán)重的水土污染、農(nóng)藥殘留超標(biāo)、耐藥性等問題，因此，具有綠色生態(tài)、無公害、不易產(chǎn)生耐藥性等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)的生物防治產(chǎn)業(yè)受到了世界各國(guó)研究機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注，擁有潛力巨大的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。而甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌作為近年來新開發(fā)的生防菌，具有抗逆性強(qiáng)、代謝產(chǎn)物豐富、抑菌譜廣等多種優(yōu)良特性，在農(nóng)業(yè)植物病害生物防治領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

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