高效液相色譜法測(cè)定日用香精中的10種香豆素及其衍生物含量

朱惠斌，王雪平

（1．黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475004；2．開封市綠色涂層材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004）

香豆素及其衍生物是一類具有芳香性氣味的物質(zhì)，廣泛存在于蕓香科、傘形科、菊科、豆科、瑞香科、茄科等高等植物及微生物的代謝產(chǎn)物中［1－4］。通常在化妝品中添加一定量的日用香精（由日用香料和輔料按一定配方調(diào)制而成的混合物），以賦予其溫馨、優(yōu)雅的香氣。但香豆素及其衍生物可能被添加在香水、沐浴啫喱、除臭劑等化妝品中。國(guó)際日化香料協(xié)會(huì)不推薦具有致敏作用的二氫香豆素、7－甲基香豆素、7－甲氧基香豆素等化合物作為日用香料成分使用；我國(guó)化妝品安全技術(shù)規(guī)范也明確規(guī)定環(huán)香豆素、4－甲基－7－乙氧基香豆素、7－甲氧基香豆素、7－甲基香豆素、二氫香豆素等香豆素及其衍生物為化妝品中的禁用物質(zhì)［5－8］。

目前香豆素及其衍生物測(cè)定方法主要有氣相色譜法（GC）［9］、高效液相色譜法（HPLC）［10］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）［11－12］。本文采用堿性甲醇超聲提取香豆素及其衍生物，提取物采用Phenomenex Luna C18柱分離，以乙腈和0．1%NH4Ac溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)在280 nm、306nm和320nm波長(zhǎng)檢測(cè)，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定日用香精中10種香豆素及其衍生物的含量，為香豆素及其衍生物等禁用物質(zhì)的監(jiān)督檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

LC－20A型液相色譜儀（日本，島津公司），附二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；JN－B－50型分析天平（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；YQ－1000C型超聲波清洗器（上海易凈超聲波儀器有限公司）；5427R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)，Eppendorf公司）；ULUP－Ⅱ型超純水器（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司）。

香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)品：香豆素（CM）、二氫香豆素（DDCM）、雙香豆素（DCM）、4－羥基香豆素（HOCM）、6－甲基香豆素（6MCM）、7－甲基香豆素（7MCM）、7－甲氧基香豆素（7MOCM）、7－乙氧基－4－甲基香豆素（EMCM）、醋硝香豆素（SCM）和環(huán)香豆素（PCM），純度均≥98%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取各香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)品適量（精度0．1mg），用甲醇溶解配制濃度為10．0mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，－18℃保存。香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)混合工作液：分別準(zhǔn)確移取各香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1．0mL于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，該溶液中10種香豆素類化合物的濃度均為200μg／mL，4℃保存。甲醇、乙腈均為色譜純，美國(guó)Tedia公司；HAc、NaOH為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1．2 液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（250×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相 A：乙腈；流動(dòng)相B：0．1%NH4Ac溶液；流速：1．0mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm（香豆素、二氫香豆素、4－羥基香豆素、6－甲基香豆素、7－甲基香豆素），306nm（雙香豆素、環(huán)香豆素、醋硝香豆素）、320nm（7－甲氧基香豆素、7－乙氧基－4－甲基香豆素）。流動(dòng)相梯度洗脫條件：初始條件80%B；0～40．0min，80%～65%B；40．0～50．0min，65%～30%B；50．0～56．0min，30%B；56．0～60．0min，80%B。

1．3 樣品前處理

稱取化妝品樣品2g（精度0．1mg）于10mL容量瓶中，加入6mL甲醇（含0．5%NaOH），渦旋振蕩30s，超聲提取20min，放至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻。轉(zhuǎn)移至15mL具塞塑料離心管中，10 000r／min離心5min，上清液經(jīng)0．22μm濾膜過(guò)濾，濾液供HPLC測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別掃描10種香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液在190～800nm波長(zhǎng)范圍紫外吸收光譜。結(jié)果表明：香豆素、二氫香豆素、4－羥基香豆素、6－甲基香豆素、7－甲基香豆素在280nm波長(zhǎng)處，有最大吸收波長(zhǎng)；雙香豆素、環(huán)香豆素、醋硝香豆素在306nm波長(zhǎng)處，有最大吸收；7－甲氧基香豆素、7－乙氧基－4－甲基香豆素在320 nm波長(zhǎng)處，有最大吸收。通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在280nm、306nm和320nm處檢測(cè)干擾峰較少，且其吸光度值與香豆素及其衍生物的含量呈正比關(guān)系，因此確定采用280nm、306nm和320nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2．2 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

分別考察了 Waters Symmetry C18、Agilent XDB C18、Inertsil ODS C18、Phenomenex Luna C18、Diamonsil C18色譜柱對(duì)香豆素及其衍生物的分離效果。結(jié)果表明：采用Phenomenex Luna C18柱（250×4．6mm，5μm）時(shí)，10種香豆素及其衍生物的色譜峰分離效果好，且色譜峰響應(yīng)值較高，峰形對(duì)稱，無(wú)拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)分別考察甲醇／乙腈－水、甲醇／乙腈－磷酸緩沖液、甲醇／乙腈－NH4Ac溶液等不同流動(dòng)相體系。結(jié)果表明：采用甲醇－水、甲醇－磷酸緩沖液、甲醇－乙酸銨為流動(dòng)相時(shí)，基線漂移嚴(yán)重，色譜峰不能實(shí)現(xiàn)有效分離；采用乙腈－水作為流動(dòng)相時(shí)，基線較平穩(wěn)，色譜峰響應(yīng)值較高，但雙香豆素、醋硝香豆素和4－羥基香豆素色譜峰拖尾；采用乙腈－0．1%NH4Ac溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫，香豆素及其衍生物分離效果較好，各色譜峰響應(yīng)值較高。因此選擇乙腈－0．1%NH4Ac溶液作為流動(dòng)相。優(yōu)化色譜條件見1．2節(jié)，所得色譜圖見圖1。

圖1 香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig．1 Chromatograms of coumarin and its derivatives

2．3 提取溶劑的選擇

根據(jù)香豆素及其衍生物的溶解特性，分別考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等有機(jī)溶劑的提取效率。結(jié)果表明：采用甲醇作為提取溶劑，雖然大部分香豆素及其衍生物的回收率較高，但二氫香豆素、環(huán)香豆素的回收率＜85%；采用甲醇（含0．5%NaOH）作為提取溶劑，10種香豆素及其衍生物，回收率平均值為95．6%。因此，實(shí)驗(yàn)選擇甲醇（含0．5%NaOH）作為提取溶劑。

2．4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

按上述所建 HPLC法，對(duì)質(zhì)量濃度分別為0．5、1．0、5．0、10．0、25．0、50．0、100．0μg／mL的香豆素及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物色譜峰峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg／mL）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表1中可知：香豆素及其衍生物在1．0～100．0μg／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）在0．9997～0．9999之間。

在空白日用香精中添加一系列低濃度的香豆素及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC法重復(fù)測(cè)定11次，分別以3倍信噪比（S／N＝3）和10倍信噪比（S／N＝10）作為檢出限（LODs）和定量限（LOQs）。從表1中可知：10種香豆素及其衍生物L(fēng)ODs為在0．15～0．90mg／kg，LOQs為0．45～3．0mg／kg。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 1 Linear equation，correlation coefficient（r2），limits of detection（LODs）and limits of quntification（LOQs）

2．5 回收率和精密度

在空白日用香精中分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的香豆素及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度測(cè)定。結(jié)果顯示：平均加標(biāo)回收率在90．1%～98．3%范圍，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1．1%～4．6%。

2．6 實(shí)際樣品的測(cè)定

隨機(jī)選取市售15份日用香精實(shí)際樣品，按上述HPLC法測(cè)定樣品中香豆素及其衍生物的含量。結(jié)果表明：2份樣品中檢出含有香豆素和4－羥基香豆素，其檢出最高含量分別為58．3mg／kg和127．3mg／kg。這表明目前市售日用香精中某些廠家非法添加香豆素或其衍生物，政府行政監(jiān)管部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其日常監(jiān)督監(jiān)測(cè)。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法測(cè)定日用香精中10種香豆素及其衍生物含量的分析方法，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單、回收率高、精密度好，適用于日用香精中香豆素及其衍生物的日常檢測(cè)。