在線固相萃?。咝б合嗌V法測定人血清中左旋舒必利

裴后猛，潘媛媛，鄭 立，鄭明剛，趙全升，石 磊＊

（1．青島大學環(huán)境科學與工程學院，山東青島266071；2．中科譜研（北京）科技有限公司，北京100027；3．國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061）

左旋舒必利作為一種苯甲酰胺類藥物，其作用特點是選擇性阻斷中腦邊緣系統的多巴胺（DA2）受體，對其它遞質受體影響較小、抗膽堿作用較輕，無明顯鎮(zhèn)靜和抗興奮躁動作用，具有較強的與氯丙嗪相似的抗精神病作用。該藥臨床主要用于精神分裂癥的系統治療，還能有效防治一些抑郁癥，對胃及十二指腸潰瘍、暈眩、偏頭痛等也有較好的治療作用［1－3］。

有關血液中左旋舒必利的測定方法，國內外已有相關報道，主要為高效液相色譜－紫外檢測法［4－5］、高效液相色譜－質譜法［6］、熒光分光光度法［7］、氣相色譜法［8－10］等。其中，熒光法靈敏度低及專一性差；氣相色譜法需要進行衍生化處理，操作繁瑣，因此在臨床上使用較少。血清樣品基質復雜，需要前處理后才能進行檢測。目前的前處理方法大多采用有機溶劑提取后，進行溶劑置換，操作復雜，且此類方法不能有效去除血清中的磷脂等內源性雜質，極易造成儀器污染。固相萃取法因為選擇性強、富集倍數高等優(yōu)勢常用于生物樣品分析中，但常規(guī)的離線固相萃取存在一些缺點，如操作繁瑣費時、技術要求高、批次重現性難以保證等，在一定程度上限制了離線固相萃取的應用。本實驗建立的在線固相萃?。咝б合嗌V法，旨在簡化操作步驟、降低分析成本，實現簡單、快捷、準確、高靈敏的檢測，滿足臨床檢測的要求。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Ultimate 3000雙三元液相色譜系統（美國，賽默飛世爾科技公司產品），附二極管陣列檢測器（DAD）。pHS－3C酸度計（上海雷磁儀器廠）；KQ－500DE型數控超聲波清洗器（科橋超聲儀器公司）；MS105DU電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

左旋舒必利對照品（純度：98%，北京百靈威科技有限公司）貯備溶液：取左旋舒必利對照品約10mg（精密稱定），置于10mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為1 000μg／mL的左旋舒必利儲備液，于冰箱內4℃保存?zhèn)溆?，標準工作溶液?0%甲醇稀釋配制。乙腈（色譜純，美國J．T．Baker公司）；甲醇（色譜純）、無水 KH2PO4（純度＞99．0%）、無水 K2HPO4（純度＞99．0%）（CNW 科技有限公司）；純水由Milli－Q純水機制備。

空白血清由北京某醫(yī)院提供。

1．2 實驗方法

1．2．1 液相色譜與在線固相萃取條件 固相萃取柱：CAPCELL PAKSCX UG80柱（10×4．0mm）；分析柱：Acclaim Mixed－Mode WCX－1柱（150×3．0mm，3μm）。固相萃取泵流動相 A為乙腈，流動相B為0．05mol／L無水KH2PO4溶液（pH＝4．5），等度洗脫，流速為1．0mL／min；分析泵流動相 A為乙腈，流動相B為0．05mol／L無水 K2HPO4溶液（pH＝6．4），等度洗脫，流速為0．7mL／min；柱溫30℃，檢測波長240nm，進樣量為100μL。

本實驗采用閥切換技術，所使用的切換閥是二位六通閥，系統流路連接見圖1。

圖1 在線固相萃?。咝б合嗌V系統流路示意圖Fig．1 Schematic diagram showing the online solid phase extraction－h(huán)igh performance liquid chromatography system

實驗過程中，0～3．0min，切換閥處于6－1連接狀態(tài)，固相萃取泵將血清上樣至固相萃取柱，樣品中左旋舒必利在固相萃取柱中保留，而蛋白等大分子物質不保留，直接流入廢液；3．0～4．0min，切換閥處于1－2連接狀態(tài)，分析泵流動相將左旋舒必利溶液從固相萃取柱轉移到分析柱上；4．0～15．0min，切換閥處于6－1連接狀態(tài)，固相萃取泵沖洗固相萃取柱并為下一針樣品平衡，分析泵繼續(xù)完成左旋舒必利的分離，具體洗脫程序和閥切換參數見表1。

表1 在線固相萃取和閥切換參數Table 1 Online solid phase extraction and valve switching parameters

1．2．2 樣品處理 空白人血清樣品在－20℃冰箱中保存，使用前取出，放置至室溫。吸取5mL血清和2倍體積的甲醇充分混合后，加左旋舒必利儲備液150μL，以4 000r／min離心10min，取上清液，即為血清標準儲備液，濃度為10μg／mL。將血清標準儲備液依次用30%甲醇稀釋，得到濃度分別為0．1、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0μg／mL的標準系列溶液，于冰箱內4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果與討論

2．1 條件優(yōu)化

2．1．1 固相萃取柱和分析柱的選擇 CAPCELLPAKSCX UG80柱是一種陽離子交換柱，它的特殊結構能夠使得蛋白質等大分子化合物直接穿透不被保留，而對小分子堿性藥物則有較好的保留，從而達到樣品基質與目標分析物的有效分離，故選用此柱作為在線固相萃取柱。Acclaim Mixed－Mode WCX－1柱是一種特殊的高效硅膠基質色譜柱，鍵合相同時具有疏水保留和弱陽離子交換特性，對左旋舒必利可提供理想的選擇性和極佳的柱效，故選用此柱作為分析柱。

2．1．2 流動相的選擇 選擇5%乙腈－95%KH2PO4緩沖溶液（pH＝4．5）作為固相萃取泵流動相，可實現左旋舒必利和樣品基質有效分離。第一次閥切換時間確定后，用乙腈和K2HPO4緩沖溶液（pH＝6．4），選擇0．7mL／min的流速，通過調節(jié)流動相比例，測試分析色譜柱的分離效果。當流動相比例為70∶30（V／V）時，Mixed－Mode WCX－1分析柱上左旋舒必利出峰時間約為9．5min，且實際血清樣品分析時，不受基質峰的干擾，最終選擇體積比為70∶30的乙腈－磷酸鹽緩沖溶液（pH＝6．4）作為分析柱流動相。

2．2 分析方法的評價

2．2．1 專屬性 按實驗方法，分別處理標準溶液和血清加標溶液，進樣分析。在選定的液相色譜條件下，舒必利的保留時間為9．48min，峰形良好，血清樣品中加標左旋舒必利（1 000ng／mL）色譜圖見圖2。

2．2．2 標準曲線 配制50、100、200、400、800、1 000、1 200、1 600ng／mL的標準工作溶液，以左旋舒必利峰面積為縱坐標（y），濃度（x）為橫坐標，結果顯示左旋舒必利在50～1 600ng／mL的濃度范圍內，其標準曲線方程為：y＝0．0156x＋0．0050（r＝0．9997），線性關系良好。

2．2．3 檢出限與定量限 將血清標準儲備液稀釋至10ng／mL，5次進樣檢測，結果顯示左旋舒必利峰信號與噪音比（S／N）均值為10．7；將血清標準儲備液稀釋至3．5ng／mL，5次進樣檢測，結果顯示左旋舒必利峰信號與噪音比S／N均值為3．2。以測得S／N≥3、S／N≥10的標準血清加標樣品的濃度分別為檢出限和定量限。血清中左旋舒必利的檢出限為3．5ng／mL，定量限為10ng／mL。

2．2．4 精密度和回收率 制備低、中、高（50、500和1 000ng／mL）3種濃度的血清加標樣品，每個濃度進行6次平行測定，進行日內與日間的精密度驗證。結果顯示，左旋舒必利在低、中、高3個濃度水平的加標回收率均在85．0%～102．9%范圍，日內、日間相對標準偏差（RSD）為1．3%～7．2%，準確度和精密度結果良好，具體見表2。

圖2 血清樣品中左旋舒必利加標色譜圖Fig．2 Chromatogram of levosulpiride in spiked samples

表2 左旋舒必利的精密度與回收率Table 2 Precision and recovery of levosulpiride in human serum spiked samples

2．2．5 穩(wěn)定性 制備低、中、高（50、500和1 000ng／mL）3個濃度的血清加標樣品，室溫（25℃）下放置，分別在0、2、4、6h進樣檢測，測試樣品穩(wěn)定性。結果顯示，低、中、高濃度水平下，各放置時間檢測值的RSD分別為0．1%、0．8%、0．5%，表明左旋舒必利在室溫放置6h穩(wěn)定性良好。

2．3 治療藥物分析

根據AGNP精神科治療藥物監(jiān)測共識指南2011［11］，對于常見精神藥物均給出了推薦的治療參考濃度范圍，左旋舒必利的治療參考濃度范圍為200～1 000ng／mL。本實驗對該濃度范圍最低點200ng／mL進行加標驗證，結果顯示測得該濃度水平加標回收率為93．8%，最高點1 000ng／mL的加標回收見精密度和回收率部分，表明該方法能夠滿足實際樣本檢測的要求。

3 結論

本文建立了血清中左旋舒必利在線樣品前處理－液相色譜分析方法，可以實現左旋舒必利低至10ng／mL濃度的準確檢測。本法專一性及耐用性強，樣品前處理簡單，很大程度上避免了樣品前處理過程中由于人為因素造成的誤差，適合臨床推廣，可廣泛用于批量樣本中左旋舒必利的濃度檢測和藥代動力學研究。