痕量氨基酸分析方法研究進(jìn)展

何繼杰，張曉鳳＊，錢莉莉，封 麗，趙天濤

（1．重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400050；2．重慶市環(huán)境科學(xué)技術(shù)研究院，重慶400045）

1 前言

氨基酸（Amino Acids，AAs）在環(huán)境、食品、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中都扮演著重要的角色，例如：水源中痕量AAs是形成含氮消毒副產(chǎn)物的重要前體物，其類型和濃度水平對(duì)含氮消毒副產(chǎn)物的控制顯得尤為重要［1］；食品中痕量AAs常以游離態(tài)、多肽和蛋白質(zhì)等形態(tài)存在，是反映食品營養(yǎng)及品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，也可反映食品是否受污染、添加合成AAs［2－5］；人體尿液或血液中痕量AAs類型與濃度可反映人體各項(xiàng)生理指標(biāo)［2］。因此，對(duì)痕量AAs的快速、準(zhǔn)確分析在環(huán)境學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、代謝組學(xué)和生物學(xué)的研究中都十分重要，受到國內(nèi)外大量研究者的高度重視。

自然界中已發(fā)現(xiàn)的AAs有300多種，其中組成生物體蛋白質(zhì)的約有20種。由于AAs種類繁多，樣品基體復(fù)雜，且大多不具有紫外或熒光信號(hào)，往往無法定量，常需借助衍生化技術(shù)將其衍生后再進(jìn)行測定。目前AAs的分析檢測方法主要有：基于通用型儀器的氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）和毛細(xì)管電泳法（CE），以及基于已商品化的氨基酸分析儀法。牟世芬等［6］和邢健等［7］對(duì)AAs的分析方法進(jìn)行了綜述，他們比較了不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)，但沒有對(duì)AAs的類型、數(shù)量、檢出限，衍生化試劑的性質(zhì)與適用范圍等方面進(jìn)行綜述?；诖耍疚膶?duì)痕量AAs分析的不同方法的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

2 氣相色譜法（GC）

采用GC法測定痕量AAs時(shí)，需先將AAs衍生為易氣化的組分，然后進(jìn)行分離檢測，其關(guān)鍵在于選擇合適的衍生化試劑和使用方法的檢測限。該方法已用于食品（酸乳酒［8］）、醫(yī)學(xué)（皮膚［9］、尿液［10－11］）、生物（玉米種子［12］、煙草［13］）和環(huán)境（發(fā)酵液［14］）等領(lǐng)域中痕量 AAs的分析，用到的色譜柱有毛細(xì)管柱［9－14］和環(huán)糊精手性柱［8］。目前，GC法使用的衍生化試劑主要有氯甲酸乙酯（Ethyl Chloroformate，ECF）、三氟乙酰丙酮（Trifluoro Acetylacetone，F(xiàn)AA）、五氟丙酸酐（Pentafluoro Propionic Anhydride，PFPA）、三氟乙酸酐（Trifluoroacetic Anhydride，TFAA）、N－叔丁基二甲基甲硅烷基－N－甲基三氟乙酰胺（N－Tert－butyl Dimethyl Silyl－N－methyl Trifluoroacetamide，MTBSTFA）和 N－甲基－N－（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N－methyl－N－（Trimethylsilyl）trifluoroacetamide，MTTFA）。其中，ECF 只能實(shí)現(xiàn)對(duì)少數(shù) AAs的衍生化［9－12］。為了更有效地衍生多種AAs，Khuhawar等［9］采用ECF＋FAA衍生化體系，實(shí)現(xiàn)了皮膚樣本中19種AAs的有效衍生化，但衍生化操作較為繁瑣。GC法采用火焰離子化檢測器的檢測限為100～1 000 μg／L［8－9］。而GC與質(zhì)譜聯(lián)用其檢測限可達(dá)到幾十至幾百ng／L，如對(duì)尿液［10］中AAs的檢測限可以達(dá)到44．8～6 244ng／L。

衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性是痕量AAs分析準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性的關(guān)鍵所在，衍生化試劑的選擇性，衍生化條件、衍生化速率、衍生化試劑的價(jià)格與危害性是操作能否順利實(shí)施需要重點(diǎn)考慮的指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道的衍生化方法的具體情況見表1。衍生化試劑FAA、PFPA和TFAA是基于與極性AAs的R基團(tuán)反應(yīng)而形成的衍生化產(chǎn)物，MTBSTFA可與含有氨基、羧基、羥基的AAs反應(yīng)，MSTFA可與含有羥基、羧酸、硫醇和胺類的AAs反應(yīng)，ECF與AAs反應(yīng)的機(jī)理文獻(xiàn)中未見報(bào)道。由此可見不同衍生化試劑對(duì)AAs衍生化的選擇性不同。目前GC法沒有一種衍生化試劑能實(shí)現(xiàn)20種基本AAs的有效衍生化，其分析測試條件有待進(jìn)一步探索與優(yōu)化，才能逐步應(yīng)用于20種基本AAs及其它各類AAs的分析測定。

表1 GC法衍生化試劑Table 1 Some derivatization reagents for analysis of AAs by GC

3 高效液相色譜法（HPLC）

3．1 HPLC柱前衍生法

HPLC柱前衍生法涉及的衍生化試劑主要有7種，根據(jù)衍生化后檢測信號(hào)不同可分為熒光型衍生化試劑，如鄰苯二甲醛（o－Phthalaldehyde，OPA）、丹酰氯（Dansyl Chloride，Dansyl－Cl））；紫外型衍生化試劑如，4－氯－3，5－二硝基三氟甲苯（4－Chloro－3，5－dinitrobenzotrifluoride，CNBF）、異硫氰酸苯酯（Phenyl Isothiocyanate，PITC）、6－氨基喹啉基－N－羥基－琥珀酰亞胺基甲酸酯（6－Aminoquinolinyl－N－h(huán)ydroxy－succinimide formate，AQC）、Dansyl－Cl和9－氯甲酸芴甲酯（9－Methyl chloroformate，F(xiàn)MOC－Cl）、2，4－二硝基氟苯（2，4－Dinitrofluorobenzene，DNFB））。HPLC柱前衍生法分析的痕量 AAs涉及到食品（枸杞［15］、麥冬［16］、樹莓［17］、稻米［18］、荔枝［19］和普洱茶［20］等）、醫(yī)學(xué)（血漿［21］、血清［22］、體液［23］和唾液［24］等）和生物（小鼠腦組織［25］、胚胎干細(xì)胞［26］、魚卵［27］）等領(lǐng)域。HPLC柱前衍生法涉及的色譜柱有 C18柱［15－17，20，．22－25］、生化分析柱［21，27］和氨基酸分析柱［19］。在現(xiàn)有的報(bào)道中，采用紫外檢測器（UVD）和熒光檢測器（FLD）的檢測限均可達(dá)幾百ng／L的水平［15－28］。檢測器的選用取決于所采用的衍生化試劑。同GC法一樣，衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性，選擇性、操作難易程度和衍生化速率，以及衍生化試劑的價(jià)格與危害性等是我們關(guān)注的重點(diǎn)。已報(bào)道方法的具體情況見表2。

衍生化過程除FMOC－Cl［28］只與AAs上的R基的醇羥基和酚羥基反應(yīng)外，其余的都能與氨基反應(yīng)，其中 AQC［26］和Dansyl－Cl［24］還能和R基上的胺反應(yīng)，而且Dansyl－Cl還能與 AAs的酚羥基反應(yīng)，故這些衍生化試劑對(duì)AAs衍生化選擇性也各有差異。綜上，除了FMOC－Cl衍生化試劑外，其它衍生化試劑都能實(shí)驗(yàn)20種基本AAs的衍生化，但AAs衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性、檢測器對(duì)其靈敏度有待進(jìn)一步考證?，F(xiàn)有報(bào)道中，以PITC或OPA為衍生化試劑，在C18柱上，通過UVD或FLD均可以實(shí)現(xiàn)20種痕量基本AAs的分析檢測，可為我們?cè)诮⒑哿緼As的分析檢測方法提供參考。

3．2 HPLC柱后衍生法

相較于柱前衍生法，柱后衍生需采用特定色譜柱和附設(shè)加溫裝置，價(jià)格昂貴，對(duì)儀器設(shè)備要求較高。衍生化試劑只涉及茚三酮（Ninhydrin，NIN）和OPA兩種，具體見表3。HPLC柱后衍生法的樣品也涉及了食品（竹筍［29］、黃酒［30］和產(chǎn)貝母［31］）和生物（花粉［32］、百合［33］、煙草［34］）等領(lǐng)域；涉及的色譜柱有：LCA K07／Li柱［30－33］、陽離子樹脂填充柱［29］、陽離子交換柱［31－32，34］，其中陽離子交換柱使用較多；陽離子樹脂填充柱在120min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了竹筍中20種基本AAs的分析測定［35］，LCA K07／Li柱在110min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了黃酒中20種基本AAs的分析測定，耗時(shí)幾乎是GC法和HPLC柱前衍生化法的2倍；檢測器以UV和FLD為主，其檢測限達(dá)μg／L水平，不及HPLC柱前衍生化法。

表2 HPLC柱前衍生法衍生化試劑Table 2 Some precolumn derivatization reagents for analysis of AAs by HPLC

表3 HPLC柱后衍生法衍生化試劑Table 3 Some post－column derivatization reagents for analysis of AAs by HPLC

衍生化過程中，衍生化試劑都是與AAs的氨基反應(yīng)［33－34］，兩種衍生化試劑的選擇性相近，但OPA成本更高。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，以NIN為衍生化試劑，在陽離子樹脂填充柱或LCA K07／Li柱上，利用FLD可實(shí)現(xiàn)20種痕量基本AAs的分離檢測分析。

4 毛細(xì)管電泳法（CE）

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量AAs的CE分離檢測，合適的分離體系是其關(guān)鍵。痕量AAs采用CE法涉及的分析樣品、緩沖液、分離電壓、衍生化試劑、分析時(shí)間、方法的檢測限等都是需要關(guān)注的幾個(gè)方面。同時(shí)由于AAs缺乏生色團(tuán)，CE法也需要對(duì)AAs先進(jìn)行衍生化處理，再進(jìn)行分離測定。滿足激光誘導(dǎo)熒光檢測器（Laser Induced Fluorescence Detector，LIFD）檢測分析涉及到幾種新的衍生化試劑：4－氯－7－硝基苯并－2－氧雜－1，3－二唑（4－Chloro－7－nitrobenzo－2－oxa－1，3－diazole，NBD－Cl）、4－氟－7－硝基苯并－2－氧雜－1，3－二唑（4－Fluoro－7－nitrobenzo－2－oxa－1，3－diazole，NBD－F）和異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）。CE法涉及到的檢測器有：LIFD、UVD、安培檢測器（Amperometric Detector，AD）和電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測（Capacitive Coupling non－contact conductivity detection，C4D）。

CE法分析檢測痕量 AAs涉及食品（蜂蜜［35］）、醫(yī)學(xué)（藥地龍［36］、淮山［37］、太子參［38］和保健飲品［39］）和生物（大腦［40］、尿液／海馬組織［41］）等領(lǐng)域；緩沖體系以硼酸鹽為主［39－41］，分離電壓在－24～22kV 之間［35－43］，這些分離條件是易實(shí)現(xiàn)的。但是該方法涉及的AAs種類相對(duì)較少，且缺乏對(duì)20種基本AAs分離分析的報(bào)道。分析時(shí)間都在20min內(nèi)，相對(duì)HPLC法和GC法明顯縮短［35－43］；由于AD具有高靈敏度，非常適用于痕量AAs的檢測，但只局限于具有電化學(xué)活性的組分。CE法涉及衍生化試劑相關(guān)信息見表4。

CE法分離效果較好，分析速度相對(duì)較快，其難以替代的優(yōu)點(diǎn)在于極低的樣品需求量，但CE法重現(xiàn)性較差是限制其廣泛應(yīng)用最大的問題。目前采用CE法進(jìn)行痕量AAs的檢測分析方面的研究較少，有許多待完善和探索的空間。

表4 CE法衍生化試劑Table 4 Some derivatization reagents for analysis of AAs by CE

綜上所述，傳統(tǒng)痕量AAs衍生化檢測分析方法研究相對(duì)較多，但操作比較繁瑣，影響因素和可能存在的干擾較多，能否適于各類未知樣本中20種基本痕量AAs的分析還有待探索，在分析速度和準(zhǔn)確性方面還有待提高。如能夠?qū)崿F(xiàn)AAs的直接分離檢測，避免衍生化過程受衍生化試劑的選擇性、中間產(chǎn)物的干擾、衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定等多種因素的影響，是實(shí)現(xiàn)痕量AAs快速、準(zhǔn)確分析的理想途徑。

5 直接測定法

傳統(tǒng)GC、HPLC和CE法分析測定痕量AAs時(shí)，要么受分離技術(shù)的限制，如GC只適用于易氣化組分，要么受分析檢測器的限制，如UV和FLD只適用于對(duì)紫外和熒光有響應(yīng)的組分，AD只適用于具有電活性的組分；痕量AAs檢測分析都需要衍生化預(yù)處理，而衍生化操作復(fù)雜，現(xiàn)有的衍生化試劑適用性范圍過窄，當(dāng)用于未知樣品中痕量AAs的快速準(zhǔn)確分析時(shí)，影響因素過多，重現(xiàn)性往往難以得到保證。目前，痕量AAs的直接檢測法主要涉及：利用HPLC法適用范圍廣的優(yōu)勢與廣譜性檢測器不受限的特點(diǎn)，HPLC－MS、HPLC－蒸發(fā)光散射檢測法（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）聯(lián)用法是比較理想的痕量AAs檢測分析方法。HPLC－積分脈沖安培檢測技術(shù)（Integrated Pulsed Amperometric Detection，IPAD）、高效陰離子交換色譜－積分脈沖安培檢測技術(shù)（HPAEC－IPAD）也是對(duì)電活性組分有響應(yīng)的痕量AAs檢測分析方法。除此之外，還有CE－MS和微流控芯片技術(shù)等等。具體見表5。

表5 直接檢測法檢測痕量AAsTable 5 Direct detection of trace AAs

相對(duì)于現(xiàn)行的其他設(shè)備，直接檢測法極大提高工作效率，減少了因檢測周期長而造成檢測時(shí)樣本內(nèi)個(gè)別AAs相互轉(zhuǎn)化的影響，尤其是生物樣本，如李鵬飛等［53］采用同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)記LC－MS／MS技術(shù)檢測AAs，在15min內(nèi)檢測人體內(nèi)30種AAs。這些新型分析手段的出現(xiàn)將大大促進(jìn)痕量AAs檢測分析技術(shù)的發(fā)展。

6 氨基酸分析儀法

除了上述基于通用型儀器的GC、HPLC、CE等方法，目前，市場上存在基于商品化的氨基酸分析儀法。該方法是基于HPLC柱后衍生法而發(fā)展起來的方法，但無需將待測AAs進(jìn)行柱前或柱后衍生，且自動(dòng)化程度比通用型儀器法更高。近來，關(guān)于采用AAs分析儀分析檢測各領(lǐng)域中的痕量AAs，結(jié)果如表6所示。

表6 氨基酸分析儀檢測痕量氨基酸Table 6 Amino acid analyzer for the detection of trace amino acids

AAs分析儀法測定痕量AAs的檢測限與基于通用型儀器的方法沒有顯著性差異，這主要是因?yàn)樗彩歉鶕?jù)HPLC柱后衍生法的原理而建立的方法，但其檢測的AAs類型相對(duì)其他方法的優(yōu)勢較為明顯，其能夠?qū)崿F(xiàn)除了20種基本AAs外的AAs的定性和定量，如You Shin等［60］采用AAs分析儀驗(yàn)證16種結(jié)構(gòu)AAs，對(duì)嬰兒配方奶粉AAs的準(zhǔn)確檢測起到重要作用，保證了奶粉的合格性。另外，王棘等分別采用HPLC法和AAs分析儀法對(duì)腸外營養(yǎng)注射液進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于HPLC法，AAs分析儀法具有操作簡便、分析快速等優(yōu)點(diǎn)，且線性范圍更廣，更適合腸外營養(yǎng)注射液中AAs的測定。

將AAs分析儀方法與基于通用型儀器法對(duì)比，重點(diǎn)關(guān)注適用AAs種類、分析時(shí)間、是否衍生化、操作難易、檢測限和重現(xiàn)性等指標(biāo)，結(jié)果如表7所示。

表7 AAs檢測方法對(duì)比Table 7 Comparison of different detection methods for AAs analysis

7 展望

基于通用型儀器法的AAs分析檢測技術(shù)需要對(duì)其進(jìn)行衍生化處理，操作過程繁瑣，影響因素較多：色譜柱類型、衍生化試劑及其適用范圍、衍生化操作難易程度、衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性、衍生化試劑成本、檢測器、檢出限等，因此確保方法的重現(xiàn)性是其實(shí)現(xiàn)痕量AAs分析檢測的關(guān)鍵。綜合考慮，痕量AAs的測定時(shí)，HPLC柱前衍生法為優(yōu)先選擇考慮的方法；而氨基酸分析儀法顯示了其專一性，很好的避免了上述問題，更能夠保證數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，但是其本身儀器價(jià)格非常昂貴，這也限制了其廣泛使用。本文已總結(jié)出多種衍生化試劑適用于20種基本AAs及其它各類AAs的定性定量分析，研究者需根據(jù)具體情況，選擇適當(dāng)分析測試條件，實(shí)現(xiàn)痕量AAs準(zhǔn)確快速分析測定。直接分析測定技術(shù)避免了繁瑣的衍生化步驟，適用于20種基本AAs的快速分析檢測，大大簡化前處理操作，其中ELSD是HPLC法的一種新型通用性檢測器，特別適用于無UV和FLD信號(hào)的AAs和糖類組分的測定，但對(duì)痕量AAs的分析檢測有待結(jié)合高效前處理技術(shù)（如固相萃取、固相微萃取等），進(jìn)一步提高該方法的檢出限。HPLC－MS的目前痕量AAs分析檢測最為理想的選擇，但還是受設(shè)備成本高的限制。