基于基因檢測方法快速鑒別不同種類畜肉

耿 多,陳 輝,羅瑞明,王麗娟

(寧夏大學,寧夏銀川 750021)

隨著人們生活水平的提高和消費觀念的轉(zhuǎn)變,肉制品的需求量逐年攀升,在利益的驅(qū)使下,很多商販為了提高商業(yè)利潤,在高價肉及肉制品中摻入廉價肉,同時使用各種添加劑調(diào)整產(chǎn)品口味及色澤,以達到以假亂真的效果。尤其是牛、羊肉卷和羊肉串等加工制品,消費者難以從紋理和口感上對其進行甄別。這些摻假肉制品的出現(xiàn)不僅嚴重侵犯了消費者權(quán)益,更對消費者的身體健康造成了嚴重危害。因此,建立一種精準、快速、高通量的檢測方法,為動物源性食品監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐,是當前亟需解決的重要問題。

目前,肉類食品成分鑒別分析技術(shù)大多只針對單一畜種樣品檢測,能夠?qū)Χ嘈蠓N畜肉同時檢測且檢測時間低于2 h的檢測方法研究較少,能對牛、羊、豬、狗、馬5個畜種畜肉同時檢測的尚未有報道。因此國內(nèi)外學者致力于降低檢測時間達到快速檢測及提高檢測通量等相關(guān)方面的研究[1]。已報道的相關(guān)檢測方法主要基于核酸分析,包括限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)[2-3]、隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD-PCR)[4]、物種特異性PCR(SSR)[5]、DNA序列分析(SA,Sequence Analysis)[6]、實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)[7]、DNA條形碼(DNA Barcoding)[8]等。從核酸分子水平上進行物種鑒別相較于蛋白質(zhì)和光譜分析具有顯著優(yōu)勢[9],因此本研究中選擇具有特異性強、不受組織類別限制等優(yōu)勢的以聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎(chǔ)的PCR凝膠電泳法,以動物種屬間遺傳信息的差異作為檢測靶點,采用縮短檢測耗時及避免操作繁瑣的梯度PCR對多畜種同時檢測。

本研究基于物種特異性PCR技術(shù),建立針對牛、羊、豬、狗、馬五個畜種源性肉的檢測方法,在研究過程中,針對牛、羊、豬、狗、馬線粒體基因篩選特異性引物,優(yōu)化各畜種檢測條件。退火溫度是PCR擴增成功的關(guān)鍵因素,為了擴增出清晰目的條帶同時避免雜帶對試驗結(jié)果的判定產(chǎn)生影響,利用梯度PCR技術(shù)優(yōu)化得到每對引物的最適退火溫度,對牛、羊、豬、狗、馬分別設(shè)計了從51～67 ℃的共計69組相應的適宜溫度及溫度梯度,并且通過比對重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank中的目的基因序列,確定牛、羊、豬、狗、馬的PCR產(chǎn)物序列分別與各自目的序列的同源性差異,以制備各畜種動物源重組質(zhì)粒,建立常見肉及肉制品快速檢測模型,以期為快速鑒別牛、羊、豬、狗、馬多畜種畜肉提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白酶K、紅色熒光核酸染色液(EB1)、瓊脂糖、Tris-Base、核酸提取液(氯仿/異戊醇(24∶1))、D2000、50×TAE、Loading Buffer、氨芐青霉素鈉、IPIG 北京索萊寶科技有限公司;HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、三水合乙酸鈉、冰乙酸(分析純) 天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司。

TGL-16D冷凍高速離心機 常州中捷實驗儀器制造有限公司;TLTERTEK BERTHOLD微量核酸蛋白濃度測定儀 美國Bio-Rad公司;Minisc及SC型水平電泳槽 美國Bio-Rad公司;Analyticjena Biosystems Tone Manual普通PCR儀 美國Bio-Rad公司;Azure Biosystems雙激光-近紅外分子成像系統(tǒng) 美國Azure Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 將5種畜肉分別使用液氮研磨儀研磨至肉糜粉末狀,4 ℃封口保存。取100 mg畜肉組織樣品,加入500 μL SDS裂解液和20 μL蛋白酶K,55 ℃水浴至溶液透明,加入等體積Tris,12000 r/min離心10 min,取上清液,重復此步操作一次,加入0.5倍體積的Tris和0.5倍體積的氯仿/異戊醇(24∶1),12000 r/min離心10 min,取上清液加入0.1倍體積的乙酸鈉溶液和2.5倍體積的4 ℃無水乙醇,待白色沉淀析出,-20 ℃沉淀2 h,12000 r/min離心5 min,吸除上清,70%乙醇500 μL洗滌沉淀,12000 r/min離心5 min棄乙醇,室溫放置揮發(fā)殘余乙醇,加入100 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀,-20 ℃保存DNA樣品。

1.2.2 特異性引物的篩選 根據(jù)已報道的現(xiàn)行檢測單一畜種方法[12-16]中的引物序列(見表1)進行篩選。DNA提取[10-11]后,采用核酸蛋白濃度測定儀和瓊脂糖凝膠電泳評估DNA質(zhì)量。PCR條件:總體積50 μL,2×Taq Plus Master Mix 25 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL,DNA模板0.5 μg。PCR條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,各引物退火溫度不同,遵循種間特異性原則,分別按表1設(shè)定溫度梯度反應,退火時間均為30 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)數(shù)分別為30、35、37和40個;72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,分析凝膠成像結(jié)果。

表1 引物序列、擴增片段大小及退火溫度范圍Table 1 The primer sequence,the size of amplified fragments and the range of specific annealing temperature

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及PCR產(chǎn)物的序列測定 a.目的片段的擴增、鑒定、回收與純化：挑選每個畜種中提取兩管DNA作為模板,用已篩選得到的各畜種特異性引物在優(yōu)化得到的最適退火溫度下進行PCR擴增,凝膠電泳成像儀鑒定后,將鑒定結(jié)果良好的PCR產(chǎn)物分兩個點樣孔全部點到瓊脂糖凝膠上,電泳結(jié)束后進行切膠操作,然后用DNA純化回收試劑盒對瓊脂糖凝膠中的DNA進行回收和純化。b. LB平板制備:待已倒好的LB平板完全凝固后,在其表面加入16 μL 50 mg/mL IPIG和40 μL 20 mg/mL的X-gal,用無菌彎頭玻璃棒將其輕輕刮涂均勻,37 ℃下放置2 h以使得溶解X-gal 的二甲基甲酰胺揮發(fā)干凈。c.冰浴操作載體連接與轉(zhuǎn)化反應：將p GM-T 克隆試劑盒中的組分在冰上完全融化后應先瞬時離心,將掛在壁上的液滴收集到管底。d.陽性克隆篩選：轉(zhuǎn)化子在平板上培養(yǎng)12～16 h后,挑選白色菌斑,此為正確的轉(zhuǎn)化子,將其挑取接種到LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜。e.菌液保存、送樣及質(zhì)粒提?。簩u床培養(yǎng)過夜后得到的渾濁菌液分成三部分,一部分按照質(zhì)粒小提試劑盒的說明進行質(zhì)粒提取;一部分送樣,由上海生工生物有限公司進行單向測序,測序所用的引物均為p GM-T載體通用引物;另一部分轉(zhuǎn)到凍存管中加入甘油保護后放置在-80 ℃條件下作為保存菌液。f.重組質(zhì)粒的鑒定。質(zhì)粒提取出來后,在微量核酸蛋白濃度測定儀上測定其濃度,同時應進行質(zhì)粒完整性檢測,最終用EB2(Emotion Buffer)將其稀釋成10 ng/μL,進行質(zhì)粒PCR。

1.2.4 序列分析軟件 利用軟件DNA star對測序結(jié)果進行處理,Gen Bank在線軟件Blast n比對測序處理結(jié)果。

1.2.5 生、熟肉檢測靈敏度及穩(wěn)定性測定 各畜種生肉清理潔凈后,水浴煮沸,99 ℃時開始計時30 min(模擬肉的蒸煮過程),瀝干水分。DNA提取后,評估DNA質(zhì)量,系列10倍稀釋,采用已篩選的特異性PCR條件進行擴增反應,無菌雙蒸水作陰性對照,確定最低DNA濃度檢測限,分析該方法靈敏性。

1.2.6 常見肉檢測準確性及可行性驗證 購買20種常見熟肉制品和復雜加工處理的生肉制品,經(jīng)沖洗后在蒸餾水中浸泡1 h,提取DNA,評估DNA質(zhì)量合格后,分別采用國家標準推薦方法與本研究優(yōu)化的快速高效檢測法進行檢測,對比本研究與國家標準檢測常見肉及肉制品動物源性成分鑒定結(jié)果,分析該方法的準確性與可行性。

1.3 常見肉類檢測

鑒別方法建立優(yōu)化后,從寧夏某幾個市場隨機購買20種常見肉類產(chǎn)品進行實際樣品檢測,進一步驗證該方法的準確度和可行性。熟肉制品和復雜加工處理的生肉制品經(jīng)沖洗后在蒸餾水中浸泡1 h,去除產(chǎn)品中部分調(diào)味料和添加劑。每個樣品DNA采用五個檢測體系同時進行檢測,綜合檢測結(jié)果得出鑒定結(jié)論。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA質(zhì)量評估結(jié)果

采用核酸蛋白濃度測定儀和瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進行評估,DNA在260、280 nm處的值均在1.8～2.0之間;DNA完整性良好,條帶清晰明亮。

2.2 特異性引物篩選結(jié)果

特異性引物和退火溫度是影響檢測結(jié)果特異性是否顯著的重要參數(shù)[17-18],因此退火溫度參數(shù)的篩選廣泛應用于物種鑒定及其群體和個體水平的遺傳差異分析中[19-21]。通過對牛、羊、豬、狗、馬的特異性引物篩選,對5畜種、9對引物、69組溫度變化、4組平行樣本(1組空白組、3組對照組)通過梯度PCR-凝膠電泳成像方法進行共計12000余次摸索篩選引物及反應條件試驗,分別比對牛(271、79 bp)、羊(133、294、98 bp)、豬(263 bp)、狗(213 bp)、馬(127 bp)等引物(圖1～圖5)退火溫度、循環(huán)數(shù)對鑒定結(jié)果的影響,分析摒棄有交叉反應、引物二聚體及無明亮清晰條帶等引物特異性差者,確定特異性引物。

圖1 牛引物快速檢測凝膠成像圖

圖2 羊引物快速檢測凝膠成像圖

圖3 豬引物快速檢測凝膠成像圖

圖4 狗引物快速檢測凝膠成像圖

圖5 馬引物快速檢測凝膠成像圖

在此過程中,檢測到牛引物1在退火溫度為63 ℃時與馬有交叉反應,在63.5 ℃時只有添加馬DNA模板的PCR體系能擴增出條帶,而當退火溫度進一步提高到64、65 ℃時無任何條帶擴增出,說明該引物特異性不好,與馬有交叉反應,棄用;牛引物2經(jīng)檢測,確定其在54 ℃退火溫度下特異性良好。分析得到,當羊引物1退火溫度為59、59.5 ℃時,其與其他五個畜種均有交叉反應,當進一步提高退火溫度到60、60.5 ℃時只能擴增出馬源性DNA,而退火溫度高于61 ℃后無任何條帶出現(xiàn),說明該引物特異性差,與馬有交叉反應,棄用;羊引物2在53 ℃退火溫度下與其他畜種均有交叉反應,當退火溫度提高到58 ℃時能擴增出其他五個畜種的DNA,只有羊DNA無法擴增出,該引物不適用于本實驗,棄用;羊引物3在低于65 ℃的退火溫度下與其他畜種均有交叉反應,而在65 ℃時特異性良好,當進一步提高退火溫度到67 ℃時無任何條帶出現(xiàn)。在豬引物方面,當退火溫度低于62 ℃時與其他畜種均有交叉反應,當退火溫度為60.5、61 ℃時,其與馬有交叉反應,當退火溫度提高到62 ℃時,其具有良好且穩(wěn)定的特異性。狗引物經(jīng)反復實驗,最終確定其在46 ℃時特異性良好,而退火溫度提高到47 ℃時該引物不穩(wěn)定。馬引物1在66 ℃的退火溫度下與驢有交叉反應,當退火溫度提高到67 ℃時其特異性良好,當退火溫度提高到67 ℃以上時無任何條帶出現(xiàn);馬引物2在60 ℃的退火溫度下與其他畜種均有交叉反應,而當退火溫度提高到62 ℃時無任何條帶出現(xiàn),棄用。

此外,本研究中曾選用的牛引物1、羊引物1(見表1)分別為Tartaglia、Herman等設(shè)計,其均為國內(nèi)飼料中牛、羊源性成分檢測行業(yè)標準所標示出來的引物,但在實驗過程中發(fā)現(xiàn),將退火溫度升至63 ℃時,此兩對引物對馬源性成分仍有擴增。但這并不意味著前人的研究有誤,而是由于前人在實驗中未對引物是否對馬源性成分有交叉反應[22]做分析和討論,本實驗的研究結(jié)果可作為對前人研究結(jié)果的補充。由此可進一步驗證,在PCR反應條件摸索確定方面,退火溫度降低時會導致非特異性擴增[23],提高退火溫度可提高反應的特異性[24],但同時擴增效率也會下降。這與桑付明[25]、黃亞威[26]、Thapana[27]等在研究中的詳盡討論相一致。在序列影響方面,有文獻[28-29]提供了根據(jù)序列中A、T、G、C四種堿基的數(shù)量來估計引物退火溫度的公式,但這些公式對其它影響因素進行考量的程度尚有缺乏,計算出的退火溫度往往和實際有較大的差距,因此理論值作為重要參考指標同時,依然需要試驗進一步摸索條件[30]。本研究在確定某一引物的退火溫度時,以引物合成報告為基準,上下5 ℃做梯度PCR,以篩選特異性退火溫度。在特異性引物篩選過程中,反應循環(huán)數(shù)的確定至關(guān)重要,一般循環(huán)數(shù)變化范圍在30～40個循環(huán)之內(nèi),通過實驗發(fā)現(xiàn),當循環(huán)數(shù)為30時,得到的擴增產(chǎn)物量較少,直觀表現(xiàn)為PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在凝膠成像儀上顯示的條帶亮度不足,而加大循環(huán)數(shù)后,非特異性條帶增多的同時也延長了擴增時間,故在同時考慮條帶亮度和擴增所需時間的基礎(chǔ)上,本實驗最終確定的最佳循環(huán)數(shù)為30。

因此,確定如圖1～圖5顯示最終五畜種的特異性引物及退火溫度為牛2(54 ℃)、羊3(65 ℃)、豬(62 ℃)、狗(46 ℃)、馬2(67 ℃),最佳循環(huán)數(shù)為30,同時檢測5種畜肉凝膠電泳檢測時長30 min。表明該方法具有對多種畜肉可同時檢測、特異性好、可重復性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。

2.3 PCR產(chǎn)物的重組質(zhì)粒初測結(jié)果及測序結(jié)果分析

2.3.1 質(zhì)粒電泳及質(zhì)粒PCR結(jié)果分析 將特異性擴增產(chǎn)物切膠純化回收后連接到p GM-T載體上,挑取經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、單克隆搖管培養(yǎng)完成后的渾濁培養(yǎng)基中牛源、羊源、豬源、狗源、馬源重組質(zhì)粒進行初步檢測,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,牛、羊、豬、狗、馬的質(zhì)粒PCR電泳,初步表明此5種特異性目的片段已成功轉(zhuǎn)化到Top10中。繼而將提取的牛源、羊源、豬源、狗源、馬源重組質(zhì)粒模板進行PCR擴增檢測。如圖7所示,牛(79 bp)、羊(98 bp)、豬(263 bp)、狗(213 bp)、馬(127 bp)的重組質(zhì)粒樣品皆獲得與預期大小相符條帶,證實牛源、羊源、豬源、狗源、馬源性目的片段已成功轉(zhuǎn)化到質(zhì)粒中,表明該引物為目標特異性引物,可進行下一步重組質(zhì)粒測序的分析。

圖6 質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果

圖7 重組質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果

2.3.2 重組質(zhì)粒測序結(jié)果 如表2所示,將牛、羊、豬、狗、馬源性的重組質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果與靶基因序列分析同源性結(jié)果,該結(jié)果表明,牛、羊、豬、狗、馬源性的PCR產(chǎn)物序列分別與Gen Bank 中的目的基因序列均有100%的同一性,測序結(jié)果進一步證明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。因此本研究中最終確定的特異性引物確為目標篩選的各畜種Cyt b中存在的牛源、羊源、豬源、狗源、馬源的特異性引物。表明本研究確定的方法真實可靠,可用于檢測鑒定此5種常見畜肉。

表2 動物源性成分測序結(jié)果與Gen bank中序列的比對Table 2 Comparison between the sequencing result and genome of bovine,ovies,pig,dog and horse

2.4 生、熟肉檢測靈敏度及穩(wěn)定性

如圖8所示,將牛、羊、豬、狗、馬的生、熟肉DNA模板量系列10倍稀釋,最低至10-8μg,采用已篩選的特異性PCR條件進行擴增反應,無菌雙蒸水作陰性對照,確定各畜種畜肉的DNA濃度檢測限。結(jié)果表明,羊的生肉和熟肉源的DNA擴增結(jié)果相同濃度間無顯著差異;牛、豬、狗和馬源性生、熟肉的DNA相同濃度間檢測結(jié)果差異顯著,牛肉的生肉檢測限為10-7μg,熟肉為10-2μg;羊肉的生、熟肉檢測限均為10-2μg;豬肉的生、熟肉檢測限分別為10-3、10-2μg;狗肉的生、熟肉檢測限分別為10-2、10-1μg;馬肉的生、熟肉檢測限分別為10-3、10-2μg。說明本研究建立的快速檢測方法不僅適用于生肉樣品檢測,同時還適用于熟肉樣品的檢測,最低檢測限為5×10-7μg,表明該方法靈敏度高。

圖8 各畜種DNA(生、熟肉)用于PCR時的靈敏度比較

2.5 常見肉類檢測

從寧夏某幾個市場隨機購買如表3所示的20種常見肉類產(chǎn)品進行實際樣品檢測,通過分析比對本研究與現(xiàn)行國家標準檢測常見肉及肉制品動物源性成分鑒定結(jié)果,進一步驗證該方法的準確性與可行性?，F(xiàn)行標準每次檢測1個樣品,每個樣品檢測時長40 min;本研究建立的快速檢測方法每次檢測5個樣品,每5個樣品檢測時長30 min。從表3中實際樣品檢測結(jié)果可以看出,該快速檢測方法與現(xiàn)行標準比較,具有同等檢測效力,且該檢測方法特異性更強,5個動物源性核酸樣品可同時檢測,檢測通量更大,檢測時間極大縮短,可為畜種鑒別及檢驗檢疫工作者提供數(shù)據(jù)理論參考。

表3 肉類檢測結(jié)果(20份樣品)Table 3 Test results of meat(20 samples)

3 結(jié)論

本文通過梯度PCR電泳法成功建立了基于牛、羊、豬、狗、馬等動物源性核酸特異性引物的快速檢測肉及肉制品基因的快速檢測方法。與現(xiàn)行肉及肉制品國家標準及地方標準相比,最低檢測限得到進一步精確,其中牛肉的生肉檢測限為10-7μg,熟肉為10-2μg;羊肉的生、熟肉檢測限均為10-2μg;豬肉的生、熟肉檢測限分別為10-3、10-2μg;狗肉的生、熟肉檢測限分別為10-2、10-1μg;馬肉的生、熟肉檢測限分別為10-3、10-2μg。蛋白質(zhì)及光譜分析檢測方法往往不適用于熟肉制品的鑒別,而本研究建立的快速檢測方法不僅適用于生肉樣品的檢測,而且完全可用于熟肉制品的檢測。此外,5個動物源性核酸樣品的同時檢測,平均每組5個樣品節(jié)省200 min,檢測通量更大,極大地縮短了檢測時間。綜上所述,本研究建立的快速檢測試劑盒方法耗時短、通量高,5種畜肉可同時進行檢測。本實驗為各檢驗檢疫等分析機構(gòu)進行實際樣品檢測提供理論依據(jù)、方法指導和技術(shù)支持,有望在各基層單位推廣應用。