鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性及熱降解動(dòng)力學(xué)研究

馬奕瑜,陳靜慧,王洪新,2,*,陳 釬,張 敏

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心,江蘇無錫 214122;3.無錫食品科技園石斛生物科技有限公司,江蘇無錫 214122)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)為蘭科(Orchidadeae)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物,主要存在于福建、安徽、浙江、廣西、云南等地[1]。研究發(fā)現(xiàn),鐵皮石斛具有抗疲勞、抗腫瘤、提高免疫力、降血脂等功效[2]。隨著研究日益深入,鐵皮石斛制品也逐漸多樣化,常見的有鐵皮石斛楓斗、石斛顆粒、石斛茶及石斛酒等。然而,野生鐵皮石斛因?qū)ιL(zhǎng)條件要求嚴(yán)苛,人為采摘嚴(yán)重過度,致其數(shù)量驟減,因此,1987年正式將其列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。鑒于此,國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注鐵皮石斛人工種植模式的研究,目前已有大棚栽培、樹上仿野生栽培、巖壁仿野生栽培等模式[3]。研究發(fā)現(xiàn)在特定仿野生模式下栽培得到的鐵皮石斛出現(xiàn)莖紫化現(xiàn)象,含有花色苷類物質(zhì)[4-5]。

花色苷是一種水溶性的天然色素,廣泛存在于花、果實(shí)、葉片中,一般由花青素通過糖苷鍵與一個(gè)或多個(gè)糖基結(jié)合而成[6]?；ㄉ找资芑瘜W(xué)結(jié)構(gòu)、溫度、pH、光照、氧氣等影響,從而導(dǎo)致分子發(fā)生異構(gòu)、聚合和降解,直接影響花色苷顏色[7]。目前,專家學(xué)者對(duì)鐵皮石斛多糖、生物堿等展開了較為全面的研究,但花色苷方面的研究報(bào)道較少。在鐵皮石斛產(chǎn)品實(shí)際加工過程中,花色苷的穩(wěn)定性會(huì)受到產(chǎn)品成分、加工工藝等影響,如食品添加劑和熱處理過程。因此鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性和熱降解性質(zhì)的研究,對(duì)鐵皮石斛產(chǎn)品的品質(zhì)評(píng)價(jià)及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)選用樹上仿野生栽培鐵皮石斛為原料,考察不同pH、溫度、光照、H2O2、Na2SO3、甜味劑和防腐劑對(duì)其花色苷穩(wěn)定性的影響,并且建立熱降解動(dòng)力學(xué)模型,為有效控制鐵皮石斛深加工產(chǎn)品實(shí)際生產(chǎn)過程中的花色苷降解提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛莖干條 由無錫食品科技園提供;鹽酸、甲酸、氫氧化鈉、無水乙醇、過氧化氫、亞硫酸鈉、氯化鉀、乙酸鈉、蔗糖、葡萄糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

400Y多功能粉碎機(jī) 鉑歐五金廠;AR224CN型電子天平、STARTER 3100型pH計(jì) 奧豪斯儀器(上海)有限公司;HH-4型恒溫水浴鍋 常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠;BC-R501C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司;SHZ-DIII型循環(huán)水真空泵 上海羌強(qiáng)實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;SCIENTZ-10N型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;UV-2100型紫外分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵皮石斛花色苷凍干粉的制備 將鐵皮石斛干粉以料液比1∶100 (m/V)加入70%乙醇(含0.1% HCl)溶液,4 ℃避光提取24 h,抽濾后于50 ℃減壓濃縮得濃縮液。將濃縮液上樣于經(jīng)過預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂[8],用3倍柱體積0.5%甲酸溶液洗去多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),再用3倍柱體積70%乙醇溶液(含1%甲酸)進(jìn)一步洗脫,50 ℃減壓濃縮,轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)中凍干,得鐵皮石斛花色苷粉末[9]。

1.2.2 pH對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響 配制1 mg/mL的鐵皮石斛花色苷溶液,調(diào)節(jié)pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,于50 ℃水浴進(jìn)行避光熱處理,每隔1 h取樣,測(cè)定此時(shí)溶液中的花色苷殘留率。

1.2.3 溫度對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響 配制1 mg/mL的鐵皮石斛花色苷溶液,調(diào)節(jié)pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,分別在50、60、70、80、90 ℃水浴進(jìn)行避光熱處理,每隔1 h取樣,測(cè)定此時(shí)溶液中的花色苷殘留率。

1.2.4 光照對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響 配制pH為2.0、濃度為1 mg/mL的花色苷溶液,分別置于25 ℃的避光和自然光條件下,每隔2 d取樣,測(cè)定此時(shí)溶液中的花色苷殘留率。

1.2.5 氧化還原劑對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響 配制pH為2.0、濃度為1 mg/mL的花色苷溶液,分別向試管中加入H2O2,使其終濃度為0.0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%,25 ℃避光靜置75 min,每隔15 min取樣,測(cè)定此時(shí)溶液中的花色苷殘留率。

配制pH為2.0、濃度為1 mg/mL的花色苷溶液,分別向試管中加入Na2SO3,使其終濃度為0.00、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%,25 ℃避光靜置10 h,每隔2 h取樣,測(cè)定此時(shí)溶液中的花色苷殘留率。

1.2.6 糖和防腐劑對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響 配制pH為2.0、濃度為1 mg/mL的花色苷溶液,分別向試管中加入蔗糖和葡萄糖,使其終濃度為0、2%、4%、6%、8%、10%,25 ℃避光靜置10 h,測(cè)定溶液中的花色苷殘留率。

配制pH為2.0、濃度為1 mg/mL的花色苷溶液,分別向試管中加入山梨酸鉀和苯甲酸鈉,使其終濃度為0.00、0.01%、0.05%、0.10%、0.20%,25 ℃避光靜置10 h,測(cè)定溶液中的花色苷殘留率。

1.2.7 花色苷含量的測(cè)定 采用pH示差法[10]。取2組1 mL的花色苷溶液,分別加入9 mL pH1.0和pH4.5的緩沖溶液,避光反應(yīng)50 min,于530和700 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.8 花色苷殘留率及熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算 花色苷的殘留率根據(jù)式(1)計(jì)算。

式(1)

式中:C0為初始時(shí)刻溶液中的花色苷含量,mg/L;t為加熱時(shí)間,h;Ct為在一定溫度下加熱t(yī)時(shí)后溶液中的花色苷含量,mg/L。

假定本實(shí)驗(yàn)中鐵皮石斛花色苷的降解符合零級(jí)或一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型,根據(jù)式(2)(零級(jí))和式(3)(一級(jí))計(jì)算降解速率k[11-12],根據(jù)式(4)計(jì)算半衰期t1/2。

式(2)

式(3)

式(4)

反應(yīng)活化能Ea根據(jù)Arrhenlus方程式(5)計(jì)算[13]。

式(5)

式中:Ea為活化能,kJ/mol;R為氣體常數(shù),R=8.314 J/mol·K;T為絕對(duì)溫度,K;K0為頻率因子,h-1。

花色苷的遞減時(shí)間D值、溫度系數(shù)Q10和Z值分別通過式(6)、(7)和(8)計(jì)算[14]。

式(6)

式(7)

T=-Zlgt1/2+b

式(8)

式中:k為T ℃下的降解速率,h-1;T為溫度, ℃。

不同溫度下的焓變?chǔ)、吉布斯自由能ΔG和熵ΔS分別通過方程(9)、(10)和(11)計(jì)算[15]。

ΔH=Ea-RT

式(9)

式(10)

式(11)

式中:Ea為活化能,kJ/mol;h為普朗克常數(shù),h=6.6262×10-34J/s;kB為玻爾茲曼常數(shù),kB=1.3806×10-23J/K;T為絕對(duì)溫度,K;k為降解速率,h-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0分析軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及差異顯著性分析,采用Origin 8.6軟件進(jìn)行線性回歸分析及繪制圖表。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖1可知,不同pH鐵皮石斛花色苷經(jīng)50 ℃熱處理5 h,均出現(xiàn)了不同水平的降解。pH1.0～3.0的降解程度明顯低于其他pH條件,其中,pH2.0的試樣在50 ℃加熱5 h后花色苷降解了3.67%,而pH8.0的試樣降解了51.40%。原因可能為在pH<3.0時(shí),花色苷主要存在形式為穩(wěn)定的紅色吡喃陽(yáng)離子,而pH4.0～8.0時(shí),主要存在形式為不穩(wěn)定的無色甲醇假堿或查爾酮[16]。結(jié)果表明,鐵皮石斛花色苷在酸性條件下較為穩(wěn)定。

圖1 pH對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

2.2 溫度對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

從圖2中可以看出,在不同pH體系下,鐵皮石斛花色苷在不同溫度下進(jìn)行熱處理5 h后均出現(xiàn)了不同水平的降解,且高溫條件下降解更為嚴(yán)重。50 ℃加熱5 h,pH1.0～8.0試樣分別有95.95%、96.33%、88.94%、78.96%、66.13%、61.33%、54.32%、48.60%的花色苷殘留。隨著溫度升高,90 ℃加熱5 h,pH1.0～8.0試樣僅有48.22%、40.51%、29.72%、24.43%、14.29%、11.22%、7.0%、3.67%的花色苷殘留。這一結(jié)果與在紅肉桃[17]、藍(lán)莓[18]中花色苷的熱穩(wěn)定性研究相一致,即升溫會(huì)使花色苷降解程度增大。由此可知,低溫條件有利于維持鐵皮石斛花色苷的穩(wěn)定。

圖2 溫度對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

2.3 不同pH和溫度下鐵皮石斛花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)研究

假定本實(shí)驗(yàn)中鐵皮石斛花色苷的降解與零級(jí)或一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型相符,在一定pH和溫度條件下,比較降解速率常數(shù)k可以得知降解反應(yīng)的快慢,比較決定系數(shù)R2以得知反應(yīng)級(jí)數(shù)[19]。由表1可知,在不同pH體系下,鐵皮石斛花色苷的熱降解速率均隨著溫度的升高而增加,且鐵皮石斛花色苷的降解在各個(gè)熱處理溫度下均與一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型相符(R2<0.9)。與不同來源如黑莓[11]、紫甘藍(lán)[13]、馬鈴薯[20]等的花色苷降解動(dòng)力學(xué)結(jié)果相似。

續(xù)表

由表2可知,在不同pH體系下,鐵皮石斛花色苷熱降解速率k均隨溫度的升高而增加,半衰期t1/2隨之減小。pH1.0～8.0體系中,活化能Ea分別為64.54、71.66、57.55、42.25、38.79、38.35、38.09、37.17 kJ/mol,pH2.0時(shí)Ea最大,Z值最小,表明在此條件下熱降解所需的能量最高,反應(yīng)最難以進(jìn)行。與本結(jié)果相似,蔣新龍[21]在黑米花色苷中研究發(fā)現(xiàn),無論體系為較低酸度(pH4.5)或較高酸度(pH1.0),皆會(huì)加速花色苷熱降解。此外,當(dāng)pH為1.0～6.0時(shí),Q10隨溫度升高而增加,表明與較低熱處理?xiàng)l件相比,在高溫情況下,加熱溫度每上升10 ℃,降解速率變化更快,而pH7.0和8.0的結(jié)果則相反,原因可能是當(dāng)環(huán)境pH為中性或堿性時(shí),花色苷的結(jié)構(gòu)向另一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,引起熱穩(wěn)定性的改變[22]。

表2 不同pH花色苷溶液在50～90 ℃熱處理?xiàng)l件下動(dòng)力學(xué)參數(shù)

續(xù)表

ΔH為反應(yīng)物和活化絡(luò)合物之間的能量差[23]。由表3可知,在一定pH條件下,ΔH受溫度變化影響較小,說明降解過程中的勢(shì)壘大小與溫度無關(guān)[14]。此外,ΔH均為正值,表明降解過程為吸熱反應(yīng),反應(yīng)溫度越高,供應(yīng)能量越多,越有利于活化絡(luò)合物的形成。

ΔG為體系的自由能變化,可用于判斷反應(yīng)能否自發(fā)進(jìn)行[15]。由表3可知,在一定pH條件下,ΔG均為正值,且受溫度變化影響較小(95.89～107.68 kJ/mol),說明降解反應(yīng)為非自發(fā)反應(yīng)。

表3 不同pH花色苷溶液在50～90 ℃熱處理?xiàng)l件下熱力學(xué)參數(shù)

ΔS為體系的熵變化,體現(xiàn)了反應(yīng)系統(tǒng)到其自身熱力學(xué)平衡之間的距離。當(dāng)pH條件固定不變時(shí),ΔS受溫度變化影響較小。pH8.0時(shí)ΔS的絕對(duì)值為188.58～190.85 J/mol,明顯高于pH2.0時(shí)ΔS的絕對(duì)值105.60～109.23 J/mol,這表明鐵皮石斛花色苷在pH2.0對(duì)溫度較不敏感。當(dāng)環(huán)境pH較低時(shí),初始系統(tǒng)與其自身熱力學(xué)平衡之間的距離較短,鐵皮石斛花色苷發(fā)生降解的概率較低[24]。

2.4 光照對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖3中可知,避光和自然光條件下的鐵皮石斛花色苷均出現(xiàn)了不同水平的降解,且自然光下的降解程度明顯高于避光條件。在避光和自然光條件下各自貯存20 d,花色苷殘留率為77.14%和21.90%。光照強(qiáng)度加大,花色苷容易出現(xiàn)酰基脫落的情況,致使穩(wěn)定性降低[18]。說明避光環(huán)境有利于鐵皮石斛花色苷的穩(wěn)定性,實(shí)際加工和儲(chǔ)存過程中應(yīng)防止陽(yáng)光照射。

圖3 光照對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

2.5 氧化還原劑對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖4可知,鐵皮石斛花色苷在添加不同體積分?jǐn)?shù)的H2O2后,均出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的降解,且降解程度隨著H2O2體積分?jǐn)?shù)的增大而增大。經(jīng)3.0% H2O2處理75 min后,花色苷殘留率為7.20%。0.0～3.0% H2O2條件下花色苷降解速率k分別為0.0001、0.0156、0.0216、0.0240、0.0274、0.0317 min-1,半衰期t1/2分別為6931、44、32、29、25、22 min。這是因?yàn)镠2O2會(huì)攻擊花色苷的C位,吡喃陽(yáng)離子遭受破壞,形成無色查爾酮物質(zhì),并進(jìn)一步發(fā)生降解[25]。

圖4 H2O2濃度對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖5可知,不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2SO3對(duì)鐵皮石斛花色苷的降解影響不同。室溫避光處理10 h后,與空白組相比,0.20% Na2SO3組的花色苷殘留率高出1.56%,而0.10%和0.15% Na2SO3組的花色苷殘留率分別降低了5.35%和1.24%。這說明0.20% Na2SO3可延緩花色苷發(fā)生降解,而其他添加量的Na2SO3加快了降解速度。

圖5 Na2SO3濃度對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

2.6 糖和防腐劑對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖6可知,添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖和葡萄糖,鐵皮石斛花色苷均發(fā)生了不同水平的降解,且降解程度隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。原因可能是蔗糖、葡萄糖等及其降解產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致花色苷降解,Daravingas等[26]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、蔗糖等能以一樣的方式加快花色苷降解,作為糖的典型降解產(chǎn)物,糠醛對(duì)花色苷的降解比羥甲基糠醛更重要。

圖6 蔗糖和葡萄糖對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖7可知,鐵皮石斛花色苷在添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的山梨酸鉀和苯甲酸鈉后,均出現(xiàn)不同水平的降解,降解程度隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大,但兩者對(duì)其影響差別不大。

圖7 山梨酸鉀和苯甲酸鈉對(duì)鐵皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

鐵皮石斛花色苷的熱穩(wěn)定性受pH影響較大,酸性條件下熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。花色苷的熱降解與一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型相符,降解速率隨溫度上升而增大,半衰期則隨之減小;在不同pH體系中,花色苷的活化能不同,pH8.0時(shí)活化能最小為37.17 kJ/mol,pH2.0時(shí)活化能最大為71.66 kJ/mol;通過熱力學(xué)分析可知鐵皮石斛花色苷的降解反應(yīng)為吸熱非自發(fā)反應(yīng)。鐵皮石斛花色苷對(duì)光照較為敏感,自然光條件條件會(huì)加速花色苷降解。H2O2促進(jìn)鐵皮石斛花色苷的降解,降解速率隨H2O2體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2SO3對(duì)花色苷降解的影響不同,經(jīng)0.2% Na2SO3處理后殘留率升高了1.56%,而添加0.10%、0.15% Na2SO3的花色苷殘留率降低。葡萄糖、蔗糖和防腐劑山梨酸鉀、苯甲酸鈉均會(huì)加快花色苷降解。建議鐵皮石斛深加工產(chǎn)品在實(shí)際加工、生產(chǎn)及貯藏過程中,控制pH為酸性,盡可能使用破壞性較小的輔料或食品添加劑,且于低溫和避光環(huán)境下進(jìn)行貯藏。