微生物來源的β葡萄糖苷酶在食品工業(yè)中應(yīng)用進展

張媛媛,蘇 敏,樸春紅,*,胡 洋,劉俊梅,薛艷杰,于寒松

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118;2.敦化市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,吉林敦化133700)

β-葡萄糖苷酶,又稱β-葡萄糖苷水解酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21),它可水解末端、非還原性的烴基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的β-D-糖苷鍵,同時釋放葡萄糖和相應(yīng)的配基。作為纖維素酶系的重要組成部分[1],β-葡萄糖苷酶主要作用于β-1,4-葡萄糖苷鍵,也能作用于β-(1,1)、(1,2)、(1,3)、(1,6)糖苷鍵,能微弱地水解對硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷[2],該酶存在于幾乎所有的生物體內(nèi),是生物體糖代謝途徑中不可或缺的一類酶。不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對分子量、結(jié)構(gòu)和組成差異很大。已有研究報道,不同微生物所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的相對分子量從幾十到幾百kDa[1],在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(Carbohydrate-active enzymes database,CAZy)中,基于氨基酸序列的同源性和結(jié)構(gòu)的相似性,將已知的β-葡萄糖苷酶分為7個家族:GH1、GH2、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116[3-5],不同來源的β-葡萄糖苷酶所屬的家族也不同,細(xì)菌、植物來源的β-葡萄糖苷酶屬于GH1家族,許多真菌來源的β-葡萄糖苷酶屬于GH3家族。

隨著國內(nèi)外研究學(xué)者對β-葡萄糖苷酶的深入研究發(fā)現(xiàn),微生物發(fā)酵產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶具有活性高、底物特異性強等特點,如青霉[6]、黑曲霉[7-9]等。同時,微生物發(fā)酵獲得的β-葡萄糖苷酶容易獲得高純度的酶制劑。因此近幾年微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的研究和應(yīng)用越來越受到廣泛的關(guān)注。本文主要闡述生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶微生物的主要來源和特性及其在食品加工中的應(yīng)用進展,分析和指出目前存在問題和解決途徑。

1 β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌株

微生物來源的β-葡萄糖苷酶其數(shù)量龐大,價格低廉,制備容易而且用途廣泛。迄今為止,大規(guī)模生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶多數(shù)來源于自然界的微生物,主要集中在霉菌、酵母菌和細(xì)菌等。霉菌來源的β-葡萄糖苷酶研究較早,也比較充分。近幾年陸續(xù)有關(guān)于酵母菌如馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、細(xì)菌如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的相關(guān)研究。

1.1 霉菌來源

霉菌一直是產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的一個重要來源,在工業(yè)中廣泛應(yīng)用。包括黑曲霉、米曲霉、綠色木霉、青霉菌等。表1列舉了部分霉菌來源的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性。從表1可以發(fā)現(xiàn),大部分霉菌β-葡萄糖苷酶的最適溫度在40～60 ℃之間,最適pH大部分為酸性,一般在4.5～6.0之間,也有部分菌株所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶偏堿性。如毛霉菌(MucormieheiYH-10)[10]和米曲霉(Aspergillusoryzae)[11]分泌的β-葡萄糖苷酶的最適pH都達(dá)到8.0。近年來,耐熱的β-葡萄糖苷酶越來越受歡迎。彭利沙等[12]從綠色木霉(TrichodermavirideGIM3.139)中分離的β-葡萄糖苷酶最適溫度為80 ℃,隨著反應(yīng)時間延長,在70～80 ℃條件下酶活可維持在90%,在80～95 ℃反應(yīng)一段時間后,酶活雖有下降趨勢,但相對酶活仍維持在50%,具有較好的耐熱性;一些霉菌分離出的β-葡萄糖苷酶在寬范圍的溫度和pH下都有較好的穩(wěn)定性。Abdella等[13]研究發(fā)現(xiàn)從耐高溫黑曲霉(AspergillusnigerNRRL3122)所分離出的β-葡萄糖苷酶最適pH為3.98,低于其他霉菌來源的β-葡萄糖苷酶,在pH為3時,其相對酶活仍能保持在70%以上。白葡萄酒釀造中,常常添加外源糖苷酶促進香氣濃郁的萜烯化合物的釋放[14],但是葡萄醪pH一般為3.0～3.5,因此耐酸性β-葡萄糖苷酶對葡萄醪中糖苷態(tài)的香氣前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化具有重要的作用。Zhou等[15]從一種來源黑曲霉(AspergillusnigerSK34.002)的β-葡萄糖苷酶在55 ℃下孵育12 h后仍保持74%的酶活性,而且在4 ℃下儲存7個月后,它的酶活性幾乎保持不變,其顯著的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性在水解工業(yè)生產(chǎn)中非常有利。

表1 部分霉菌來源的β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)

不同來源的β-葡萄糖苷酶水解底物的類型也不同,如對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)、水楊苷、纖維二糖等。Xie等[7]從黑曲霉(AspergillusnigerNo.5.1)分離出的β-葡萄糖苷酶水解p-NPG和纖維二糖比水解對硝基苯-β-D-吡喃木糖苷、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖和七葉苷更有效,但不能水解結(jié)晶纖維素。常軍等[9]從黑曲霉(Aspergillusniger)分離的β-葡萄苷酶對纖維二糖的親和性最大,對麥芽糖、昆布糖幾乎沒有水解作用,說明該酶可水解β-1,4-糖苷鍵,但基本上不水解α-1,4-糖苷鍵和β-1,3-糖苷鍵。Guo等[16]從根毛霉(RhizomucormieheiCAU432)分離的β-葡萄糖苷酶在芳基糖苷中對p-NPG水解性最高,在低聚糖中對昆布二糖水解性更高,可催化各種寡糖中β-1,2、β-1,3、β-1,4和β-1,6鍵的裂解,尤其是β-1,3-糖苷鍵并具有較高的轉(zhuǎn)糖基活性,在一定條件下可將葡萄糖和纖維二糖合成龍膽二糖。Gao等[17]從青霉菌(Pencilliumpiceum)分離的β-葡萄糖苷酶對水楊苷的水解性更高,并且也能水解木糖,是一種具有β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性的新型雙功能糖苷水解酶。每種酶的獨特性質(zhì)為食品藥品行業(yè)特定需求提供更多的選擇性。

1.2 酵母菌和乳酸菌來源

發(fā)酵在食品工業(yè)中占有非常重要的地位,特別是酵母菌和乳酸菌發(fā)酵。很多食品原料中,大部分芳香物質(zhì)以糖苷前體形式存在,發(fā)酵過程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可以將它們釋放為游離的芳香物質(zhì),提高產(chǎn)品的感官特性和質(zhì)量。另一方面,部分霉菌會產(chǎn)生對人身體有害的毒素[21],不能直接加入到食品中。因此,擴大β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)種類也顯得越發(fā)重要。表2列舉了部分酵母菌和乳酸菌來源的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性。

表2 部分酵母菌和乳酸菌來源的β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)

釀酒酵母一直以來是葡萄酒發(fā)酵的主要微生物,但是越來越多的研究表明,非釀酒酵母如長飽洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)、發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)在葡萄汁酒精發(fā)酵中發(fā)揮重要作用,發(fā)酵過程中貢獻(xiàn)更多的芳香類化合物[22-23],使葡萄酒具有更加復(fù)雜的口感和香氣,與其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶有關(guān)。已有研究證明馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)是耐熱β-葡萄糖苷酶的有效生產(chǎn)者[24]。K.marxianus菌株常見于各種奶制品,如kefir粒、軟奶酪、奶酪等,已經(jīng)被分離和鑒定[25-26]。K.marxianus顯示了一些獨特的性質(zhì),由于其在各種底物和環(huán)境中的耐高溫能力[27]、生長速率快和富含豐富的酶系統(tǒng)的特點,如脂肪酶[28]、蛋白酶[29]、葡聚糖酶[30]、β-葡萄糖苷酶[31]等,是工業(yè)過程中理想的微生物原料。不同的來源的K.marxianus,如釀酒酵母和乳酸克魯維酵母[27]是食品安全級的,并且在歐洲已經(jīng)被列入食品安全生物制劑的權(quán)威名單中,可以添加到食品和飼料中[32]。目前,研究表明K.marxianus可以作為益生菌,其效果在臨床研究已經(jīng)得到認(rèn)可[33-35],并且發(fā)現(xiàn)該菌株具有高β-葡萄糖苷酶的活性[36]。除此之外,食品安全級的乳酸菌也可以分泌出獨特的β-葡萄糖苷酶。Ko等[37]從朝鮮泡菜乳酸菌(LactobacilluskimchiJB301)發(fā)酵液中分離出的β-葡萄糖苷酶,可以將虎杖中提取的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇,產(chǎn)率高達(dá)99%,與其他來源的β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)成本高和發(fā)酵過程中可能產(chǎn)生的毒性[38-39]弊端相比,LactobacilluskimchiJB301來源的β-葡萄糖苷酶具有高食品安全性特點,在功能性食品中有較高潛在應(yīng)用價值。

1.3 其它微生物來源

除了上述來源的β-葡萄糖苷酶外,還有一些其他來源的β-葡萄糖苷酶具有其獨特的性質(zhì),表3列舉了其他微生物來源的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性。

表3 其他來源的β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)

Hernandez-Guzman等[48]從申克孢子絲菌(SporothrixschenckiiEH-206)發(fā)酵液分離的β-葡萄糖苷酶,為由兩個相同亞基構(gòu)成的二聚體,每個亞基的分子量96.8 kDa,其分子量在197 kDa左右,主要水解纖維二糖、昆布糖、4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷和對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。Asic等[49]所研究的雙孢蘑菇菌(Agaricusbisporus)分泌的β-葡萄糖苷酶催化反應(yīng)迅速,最大反應(yīng)速率為833 U/mg,是由兩個分子量大約為46和62 kDa亞基構(gòu)成的二聚體。變形桿菌(ProteusmirabilisVIT117)[50]分離的β-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出極強的耐堿能力,其最適pH為9.0,而從嗜熱微生物中分離出來的β-葡萄糖苷酶顯示出極強的耐熱能力,如Mallek-Fakhfakh等[51]發(fā)現(xiàn)的嗜熱真菌(TalaromycesthermopHilus)分泌的β-葡萄糖苷酶在50 ℃下可以穩(wěn)定34 h,Kong等[52]從嗜熱細(xì)菌(ThermotoganapHthopHilaRUK-10)發(fā)酵液分離出的重組β-葡萄糖苷酶最適溫度為95 ℃,在75、80、85和90 ℃下的半衰期是分別為84、32、14和3 h。

2 β-葡萄糖苷酶在食品中的應(yīng)用

β-葡萄糖苷酶可以廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)、保健品、生物能源、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域[56],特別是食品工業(yè)和保健品領(lǐng)域。果汁、果酒和茶葉中存在多種風(fēng)味物質(zhì)且極易揮發(fā),但自身又存在沒有香味且不易揮發(fā)的風(fēng)味前體物質(zhì),在β-葡萄糖苷酶作用下裂解糖苷鍵,產(chǎn)生具有濃郁香氣的芳香物質(zhì)。因此,在食品工業(yè)中β-葡萄糖苷酶可以起到增香的作用。在保健品行業(yè)中,β-葡萄糖苷酶可將異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為較高活性的異黃酮苷元,也可以使白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇,具有較高的應(yīng)用價值。

2.1 果汁中應(yīng)用

β-葡萄糖苷酶用作食品添加劑[57]作用于水果中的芳香前體物質(zhì),利于果汁脫苦和果汁增香。高倩[58]對廉江紅橙果汁添加外源β-葡萄糖苷酶,增加了紅橙果汁中3-蒈烯、安息香醛、環(huán)己醇等風(fēng)味成分,改善了紅橙果汁的風(fēng)味,起到了增香的作用。王鵬等[59]對蟠桃汁進行β-葡萄糖苷酶酶解處理,蟠桃汁的桃果香、花清香、香甜味顯著增加,不良風(fēng)味屬性(異味和蒸煮味)顯著降低。張瑤等[60]采用氣相色譜-質(zhì)譜法對新鮮檸檬汁和β-葡萄糖苷酶酶解處理的檸檬汁的香氣成分進行測定,發(fā)現(xiàn)酶解后檸檬汁的香氣種類增加且酶解汁中香氣成分總量增加了11%,不僅釋放出新的香氣物質(zhì),還對加工過程中損失的香氣起到彌補作用。此外,β-葡萄糖苷酶也可用于果汁脫苦,可以有效地降低胡柚汁中檸檬苦素、柚皮苷等苦味物質(zhì),幾乎不影響果汁中VC等營養(yǎng)成分[61]。

2.2 葡萄酒中應(yīng)用

在葡萄酒的生產(chǎn)中,β-葡萄糖苷酶能夠顯著增加葡萄酒中的糖苷萜烯類前體物質(zhì)的水解和單萜類物質(zhì)的釋放,在葡萄酒香氣形成過程中起著重要作用[62]。Hu等[63]研究發(fā)現(xiàn)來自H.uvarum菌株的β-葡萄糖苷酶顯示出對C13-異構(gòu)體和一些萜類的芳香糖苷的催化特異性,在葡萄酒釀造中增強了葡萄酒中鮮花、甜味、漿果和堅果的香氣特征。另外,添加β-葡萄糖苷酶的葡萄酒不僅使會單萜、酚類和降異戊二烯的濃度顯著增加,且葡萄酒本身的成色物質(zhì)幾乎不會受到損失[64-65]。Hu等[66]研究發(fā)現(xiàn)來自微生物的一種新的β-葡萄糖苷酶顯示出對苯基化合物和C13-異構(gòu)體的糖苷的水解特異性,并且對釀酒條件表現(xiàn)出很強的耐受性,進一步改善葡萄酒的花香和水果香味特征。

2.3 其他

β-葡萄糖苷酶還可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大豆異黃酮提高保健功能方面[67]。Baú等[68]優(yōu)化豆?jié){加工中β-葡萄糖苷異黃酮向糖苷配基的轉(zhuǎn)化研究,在豆?jié){加熱中維持大豆黃素和染料木黃酮苷元含量,黃豆黃素和β-葡萄糖苷含量增加,丙二酰葡萄糖苷含量降低。Abdella等[13]將黑曲霉產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶水解大豆粉異黃酮糖苷,用Box-Behnken優(yōu)化反應(yīng)影響因素,確定染料木黃酮生產(chǎn)的有效變量,染料木素的濃度增加了11.73倍,發(fā)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化使抗氧化活性增加了四倍。Pyo等[46]將β-葡萄糖苷酶添加到豆奶中,能夠?qū)⑤^低的異黃酮糖苷物質(zhì)有效轉(zhuǎn)化為高活性的異黃酮苷元,其中苷元(大豆黃素+染料木黃酮)平均增加7.1倍。

近幾年,β-葡萄糖苷酶在高生理活性的單體的生產(chǎn)方面應(yīng)用備受關(guān)注,如白藜蘆醇和人參稀有皂苷。β-葡萄糖苷酶可以將白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇,目的產(chǎn)物得率高,具有較可觀的工業(yè)化應(yīng)用前景。Gaensly等[69]篩選了308個本地酵母菌株,其中Hanseniasporauvarum生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶在發(fā)酵過程中顯示出有效轉(zhuǎn)化白藜蘆醇葡萄糖苷的能力。馮薇等[70]對虎杖復(fù)合酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和虎杖苷專用酶進行白藜蘆醇苷酶解制備白藜蘆醇的工藝,發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)化效果最好。Zhou等[15]將虎杖通過β-葡萄糖苷酶的酶促切割而產(chǎn)生白藜蘆醇,幾乎所有虎杖中的白藜蘆醇苷都轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。

β-葡萄糖苷酶可以有效的水解人參皂苷,將大量的常見皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷,是大量獲得稀有人參皂苷的新途徑[71]。Siddiqi等[47]利用β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)移葡萄糖基的作用,可以將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg3。邵巍等[55]研究利用β-葡萄糖苷酶將人參皂苷Rb1的C-21位兩個-GLc鍵水解,進而轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3。

3 展望

微生物來源的β-葡萄糖苷酶資源的挖掘和酶學(xué)特性的分析已經(jīng)取得了長足的進展,特別是在食品微生物來源的β-葡萄糖苷酶的特性和應(yīng)用,越來越受到食品加工領(lǐng)域的關(guān)注,但仍存在一些問題亟待解決。第一:雖然關(guān)于微生物β-葡萄糖苷酶研究報道較多,但實際市售的β-葡萄糖苷酶的提取來源大多還是來源于杏仁,由于原料有限,其價格相對較高,要應(yīng)用于大規(guī)模的食品工業(yè),就單從成本考慮限制其應(yīng)用。這說明微生物來源的β-葡萄糖苷酶雖然有巨大的開發(fā)價值,但是由于其產(chǎn)酶量少,活性低,大大限制了研究成果的轉(zhuǎn)化。進一步結(jié)合基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù),挖掘高活性β-葡萄糖苷酶微生物和優(yōu)化價格低廉的生產(chǎn)工藝將是亟待解決的問題。第二:與其他來源的酶相比,β-葡萄糖苷酶底物特異性較廣泛,而在大多數(shù)研究中發(fā)現(xiàn)其最適底物基本為p-NPG,對其他類型的β-葡萄糖苷鍵的底物親和性相對較低,而p-NPG不是食品成分。因此,尋找對自然底物更強特異性的β-葡萄糖苷酶,挖掘潛在的生物學(xué)功能是目前的重要挑戰(zhàn)。第三:β-葡萄糖苷酶在食品風(fēng)味改良方面的研究已經(jīng)普遍得到認(rèn)可,但是目前應(yīng)用領(lǐng)域多限制在葡萄酒和茶葉的增香方面。與人工添加的芳香物質(zhì)相比,酶解產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)更具有安全性,能滿足消費者對食品原汁原味的需求。拓寬β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒋龠Mβ-葡萄糖苷酶的創(chuàng)新和研究發(fā)展,在食品工業(yè)中極具應(yīng)用價值,為食品工業(yè)帶來新的發(fā)展契機。