五味子多糖對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠肝細胞凋亡的影響

車金營,楊 碩,喬子敬,楊雪晗,李 賀,孫靖輝,陳建光,王春梅

(北華大學(xué)藥學(xué)院,藥理教研室，吉林吉林 132013)

藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury,DILI)通常指肝臟受藥物及其代謝產(chǎn)物毒性損傷或超敏反應(yīng)引起的疾病,是當(dāng)前急性肝損傷最為常見的病因之一,嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性肝衰竭甚至死亡[1]。最新的研究表明,每年DILI在我國普通人群中的發(fā)病率至少為23.80/10萬人,占藥物不良反應(yīng)的10%左右,因此防治DILI對降低臨床肝病的發(fā)生率具有重要意義[2]。對乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥,過量攝入可使肝細胞中產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物——N-乙酸-對苯醌亞胺,耗竭谷胱甘肽(Glutathione,GSH),引起氧化應(yīng)激及線粒體損傷,致使肝細胞發(fā)生凋亡及壞死,是建立急性DILI模型常用的工具藥,也是引起急性DILI的最常見原因之一[3]。

五味子(Schisandrachinensis(Turcz)Baill)為我國傳統(tǒng)保肝藥物。有研究表明五味子發(fā)揮護肝作用的主要成分是其脂溶性成分木脂素類[4]，但中醫(yī)藥的傳統(tǒng)使用方法為水煎,提示其水溶性成分是具有藥理活性的。近年來五味子多糖(Schisandrachinensispolysaccharide,SCP)的降酶護肝、促進肝臟再生等作用研究越來越受到關(guān)注[5]。課題組的前期研究已證實SCP對酒精、CCl4、高脂飲食等誘導(dǎo)的肝損傷都有一定的保護作用,且具有顯著的抗氧化活性[6-10]。目前,SCP對APAP致急性DILI保護作用的研究鮮有報道、其作用機制也尚不明確。

因此,本實驗采用一次性腹腔注射APAP誘導(dǎo)的小鼠急性嚴(yán)重肝損傷模型,進一步觀察SCP對急性藥物性肝損傷的保護作用,同時探討SCP是否通過抑制APAP誘導(dǎo)的肝細胞凋亡而發(fā)揮保護肝損傷作用,以期為今后五味子的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子 吉林省集安五味子種植基地;氨基磺酸、間羥基聯(lián)苯 美國Sigma公司;葡萄糖、無水乙醇 北京市化學(xué)試劑公司;苯酚、濃硫酸 國藥化學(xué)試劑集團,分析純;對乙酰氨基酚(批號A105808-25g) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;雄性ICR 小鼠50只,體重19～22 g,長春伊斯實驗動物技術(shù)有限公司(合格證號:SCXK(吉)2016-0004);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、丙二醛(MDA)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)蘇木精和伊紅(HE)染色試劑盒、谷胱甘肽(GSH) 南京建成生物工程研究所;Hoechst 33258染色、ECL顯影液及BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;HCL-Tris、30%丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨及甘氨酸 北京鼎國試劑公司;脫脂奶粉 美國BD公司;p-JNK、JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3抗體 武漢ABclonal公司。

Shimadzu HPLC系統(tǒng)(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外光檢測器)、Thermo ODS HYPERSIL高效液相色譜柱 日本島津公司;Infinite M200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan集團;Western blot電泳儀、電轉(zhuǎn)儀 美國Bio-Red 公司;Nikon Eclipse Ti-SR倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五味子多糖制備 稱取五味子干燥果實1.5 kg,加入10倍量蒸餾水浸泡24 h,煮沸2次(3+2 h),合并提取液并以80 ℃濃縮至2 L,將濃縮液離心(4500 r/min,15 min),棄去沉淀。向上清液中加入95%乙醇,使乙醇終濃度為75%(用酒精計測定),沉淀24 h,離心(4500 r/min,15 min),收集沉淀。將沉淀依次用95%乙醇和無水乙醇洗滌,水浴蒸干,得粉末狀SCP[6]。按照式(1)計算SCP得率。

SCP得率(%)=SCP質(zhì)量(g)×100/五味子質(zhì)量(g)

式(1)

1.2.2 五味子多糖化學(xué)組成分析 配制0.01 mg/mL葡萄糖溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用苯酚-硫酸法測定糖含量[11];應(yīng)用間羥基聯(lián)苯法測定SCP中糖醛酸的含量[12];考馬斯亮藍法測定蛋白含量[13];1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化和高效液相色譜法(HPLC)進行單糖組分分析[14]。HPLC法采用Shimadzu HPLC系統(tǒng)(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外檢測器),DIKMA Inertsil ODS-3 色譜柱(4.6×150 mm),流動相為0.1 mol/L的PBS,pH7.0-乙腈82∶18 (v/v),流速1.0 mL/min,35 ℃檢測,進樣量20 μL,檢測波長為245 nm。

1.2.3 APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的建立及分組 將雄性ICR小鼠50只,分為5組,分為對照組(CON)、肝損傷模型組(MOD)和25、50、100 mg/kg SCP組,每組10只。SCP各給藥組給予相應(yīng)劑量的SCP,CON組及MOD組給予同體積的生理鹽水,連續(xù)灌胃2周,每天一次。末次給藥后1 h,MOD組及SCP各給藥組小鼠一次性腹腔注射APAP(250 mg/kg),CON組以相同方式給予生理鹽水[15]。所有小鼠均禁食不禁水。24 h后眼球取血,3500 r/min,4 ℃離心5 min,分裝血清。將小鼠斷髓處死,小心取出肝臟,生理鹽水清洗后濾紙吸干水分,觀察肝臟整體形態(tài),稱量并按照式(2)計算肝指數(shù):隨后將肝組織一部分用福爾馬林固定,另一部分保存于-80 ℃冰箱中。

肝指數(shù)(mg/g)=肝質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

式(2)

1.2.4 小鼠血清中ALT、AST及肝組織中GSH、MDA水平檢測 采用酶法檢測小鼠血清中ALT及AST水平;另取肝組織100 mg,加入9倍量的生理鹽水于冰水浴中制成10%組織勻漿,3500 r/min離心10 min,取上清液,采用二硫代對硝基苯法和硫代巴比妥法試劑盒測定GSH及MDA水平[6]。所有檢測方法均依據(jù)南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行測定。

1.2.5 HE染色 取福爾馬林固定的肝組織,經(jīng)石蠟包埋、切片,進行蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肝細胞病理形態(tài)變化[9]。

1.2.6 Hoechst 33258染色 將5 μmol/L的石蠟切片脫蠟水化后,根據(jù)Hoechst 33258染色試劑盒的說明進行染色,并在倒置熒光顯微鏡下觀察染色的細胞核[15]。在顯微鏡高倍視野下隨機選取3個區(qū)域,以計算陽性肝細胞數(shù)及肝細胞總數(shù)。根據(jù)式(3)計算。

肝細胞凋亡率(%)=陽性肝細胞數(shù)×100/肝細胞總數(shù)

式(3)

1.2.7 Western blot 法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達水平 將凍存的肝組織取出,加入裂解液,冰上裂解1 h,離心(4 ℃、12000 r/min、10 min)收集上清液。采用BCA法測定樣本蛋白濃度,在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離目標(biāo)蛋白,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜2 h,隨后用封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)封閉1 h。室溫孵育后棄去封閉液,加入p-JNK、JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3第一抗體(1∶1000)4 ℃過夜[10]。次日用TBST緩沖液洗滌3×10 min,并與第二抗體(1∶5000)室溫下孵育1 h,TBST緩沖液洗滌3×10 min,最后加入ECL顯影液,并在化學(xué)發(fā)光儀器上觀察條帶并通過圖像分析分析結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子多糖化學(xué)組成分析

本研究采用經(jīng)典的水提醇沉法制備五味子多糖[7],由表1可知,SCP得率為8.55%,糖含量為40.60%,糖醛酸含量為24.70%,蛋白質(zhì)含量為1.51%。從單糖組成分析結(jié)果顯示SCP中葡萄糖和半乳糖醛酸的含量較高,分別占38.00%及36.70%,其次是半乳糖、阿拉伯糖及鼠李糖,分別占12.00%、7.30%、4.00%,同時還含有少量的甘露糖,約占1.20%。

表1 五味子多糖的化學(xué)組成分析(%)

2.2 各組小鼠肝質(zhì)量及肝指數(shù)

肝指數(shù)的變化通常能夠反映肝組織是否腫大、萎縮,也是反映肝組織損傷程度的指標(biāo)之一[16]。由表2可知,與CON組相比,MOD組小鼠肝質(zhì)量和肝指數(shù)顯著升高(p<0.05),說明一次性腹腔注射250 mg/kg APAP可引起肝組織水腫,肝損傷造模成功。而與MOD組相比,50及100 mg/kg SCP組小鼠的肝質(zhì)量及肝指數(shù)均顯著下降(p<0.05),而25 mg/kg SCP組下降不顯著(p>0.05)表明適當(dāng)劑量的SCP能夠減輕APAP引起的肝組織水腫,保護肝損傷。

表2 各組小鼠肝質(zhì)量及肝指數(shù)(n=10)

2.3 各組小鼠血清中ALT、AST及肝組織中GSH、MDA水平

肝臟是藥物在體內(nèi)代謝的主要場所,最容易受到藥物的影響[17]。當(dāng)肝細胞受損時,細胞內(nèi)的ALT和AST被大量釋放到血液中,使血液中酶活性顯著增加。因此,血清中ALT和AST水平被認為是反映肝臟受損的敏感指標(biāo)[18]。由表3可知,與CON組相比,MOD組小鼠血清中ALT、AST水平極顯著升高(p<0.01),表明一次性大劑量注射APAP可使小鼠肝細胞損傷。而與MOD組相比,25及50 mg/kg SCP組小鼠血清中ALT、AST水平顯著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP組小鼠血清中ALT、AST水平極顯著降低(p<0.01),表明SCP對APAP誘導(dǎo)的急性肝細胞損傷具有一定的保護作用。

相關(guān)研究表明:過量的APAP經(jīng)肝臟CYP450酶代謝產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物,致使肝細胞內(nèi)GSH快速消耗,產(chǎn)生氧化應(yīng)激進而引起肝細胞損傷[19]。由表3可知,與CON組相比,MOD組小鼠肝組織中GSH水平顯著下降(p<0.05),MDA水平顯著升高(p<0.05),表明小鼠機體的抗氧化能力顯著下降。而與MOD組相比,50 及100 mg/kg SCP組肝組織中GSH水平顯著升高、MDA水平顯著降低(p<0.05),表明SCP可以通過提高機體抗氧化能力改善APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。

表3 各組小鼠血清中ALT、AST及肝組織中GSH、MDA水平(n=10)

2.4 各組小鼠肝臟形態(tài)及組織病理學(xué)

由圖1可知,觀察小鼠解剖后的肝臟,CON組小鼠肝臟顏色為紅褐色,表面光滑。MOD組小鼠肝體積增大,局部點狀區(qū)域呈土黃色,顯示肝組織部分壞死。組織病理學(xué)顯示:CON組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細胞形態(tài)正常,肝索排列規(guī)則。MOD組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,中央靜脈附近出現(xiàn)炎性浸潤及部分變性壞死,肝細胞胞漿疏松化。表明APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型建立成功。

圖1 各組小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)比較

與MOD組相比,SCP各給藥組小鼠解剖后的肝臟顏色及組織壞死程度介于MOD組與CON組之間,均有不同程度的變化。組織病理學(xué)顯示SCP各給藥組小鼠肝索排列趨于整齊、肝細胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn),中央靜脈附近的炎性浸潤及變性壞死較MOD組明顯減少。表明SCP可改善APAP誘導(dǎo)小鼠肝組織病理學(xué)變化。

2.5 各組小鼠肝細胞凋亡現(xiàn)象

為了進一步探討SCP是否抑制APAP誘導(dǎo)的肝細胞凋亡,采用Hoechst 33258染色觀察了肝細胞的凋亡情況。結(jié)果由圖2a可知,CON組肝細胞排列整齊,規(guī)則,形態(tài)良好,幾乎沒有亮藍色濃染的細胞,MOD組的中央靜脈的肝細胞核呈現(xiàn)出明亮的致密性濃染,細胞核固縮,表明過量的APAP可以使小鼠肝細胞凋亡增加。SCP各給藥組肝細胞內(nèi)亮藍色濃染均不同程度減輕,且程度介于MOD組及CON組之間。CON組、MOD組、25、50及100 mg/kg SCP組的肝細胞凋亡率依次為16.56%、57.83%、39.45%、32.29%和23.71%。由圖2b可知,與CON組相比,MOD組細胞凋亡率極顯著增加(p<0.01);而與MOD組相比,25 和50 mg/kg SCP組細胞凋亡率顯著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP組肝細胞凋亡率極顯著降低(p<0.01)。這些結(jié)果表明SCP對APAP誘導(dǎo)肝損傷的保護作用可能是通過抑制細胞凋亡實現(xiàn)的。

圖2 各組小鼠肝組織細胞凋亡情況(a)及肝細胞凋亡率(b)(100×)

2.6 Western blot 法檢測小鼠凋亡蛋白表達水平

Baek[20]等研究發(fā)現(xiàn),APAP介導(dǎo)細胞凋亡的Caspase通路是其造成急性肝損傷的必要途徑。為了探討SCP抑制APAP誘導(dǎo)肝細胞凋亡的機制,進一步檢測肝組織中Cleaved caspase-3、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達情況。由圖3可知,與CON組相比,MOD組Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達水平極顯著升高(p<0.01),且Bcl-2的表達水平極顯著降低(p<0.01),表明過量的APAP可激活凋亡通路相關(guān)蛋白,促進細胞凋亡。而與MOD組相比,25和50 mg/kg SCP組Bax蛋白表達顯著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP組Bax蛋白表達極顯著降低(p<0.01),SCP各組Cleaved caspase-3表達極顯著降低,Bcl-2表達極顯著升高(p<0.01)。表明SCP可顯著抑制APAP誘導(dǎo)的凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達量的增加以及Bcl-2表達的降低。同時,有研究表明在過量APAP造成肝損傷的過程中,JNK被磷酸化激活并進入線粒體是關(guān)鍵步驟[21],而JNK磷酸化后能夠影響B(tài)cl-2家族相關(guān)蛋白表達,Bcl-2會阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì),抑制Caspase家族的級聯(lián)反應(yīng)[22]。結(jié)果由圖3B可知,與CON組相比,MOD組p-JNK表達水平極顯著增加(p<0.01);表明過量的APAP會激活JNK,使其磷酸化增加。與MOD相比,50及100 mg/kg SCP組p-JNK蛋白表達水平顯著降低(p<0.05),25 mg/kg SCP組p-JNK蛋白表達水平降低不顯著(p<0.05)。這些結(jié)果表明SCP可能通過阻斷JNK的磷酸化,進而抑制APAP引起的細胞凋亡。

圖3 各組小鼠肝組織p-JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達情況

3 結(jié)論

本研究采用一次性給予小鼠APAP(250 mg/kg)建立急性肝損傷模型,觀察SCP對APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護作用及對肝細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示:SCP可明顯降低小鼠肝臟指數(shù),血清轉(zhuǎn)氨酶水平,改善肝臟病理變化,對APAP誘導(dǎo)的DILI具有顯著的保護作用。SCP能顯著減少MDA含量、緩解GSH的消耗,提高了機體的抗氧化能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)SCP能顯著降低肝組織中Cleaved caspase-3、Bax及升高Bcl-2的蛋白表達,說明SCP對APAP誘導(dǎo)的細胞凋亡具有抑制作用,其作用機制可能與抑制JNK信號通路的激活有關(guān)。本研究證實了SCP對APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用,這為五味子的深入研究及開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。