童子益母草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

孫蕓，班小軍，楊璽文，陳曉青，趙翠琴，謝世斌，張建民

(張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 張掖 734000)

童子益母草為唇形科植物益母草Leonurusartemisia(Lour.)S. Y. Hu的干燥幼苗或基生葉，具有活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫，清熱解毒作用，用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)閉經(jīng)，惡露不凈，水腫尿少，瘡瘍腫毒[1]。其主要化學(xué)成分，生物堿：益母草全草含生物堿 0.11%～2.09%，其中益母草堿(1eonurine)0.02%～0.12%、水蘇堿(stachydrine)0.59%～1.72%和益母草啶(1eonuridine)、益母草寧(1eonurinine)，其主要成分為鹽酸水蘇堿[2]，從主要化學(xué)成分來看，水蘇堿在全草生物堿中含量比例最高，所以本標(biāo)準(zhǔn)確定含量測定的生物堿成分首先確定鹽酸水蘇堿。童子益母草雖然沒有被《中國藥典》收載，但作為商品已經(jīng)在市場上流通使用，近年來，童子益母草常在中藥處方中應(yīng)用，不僅作用療效好，且價(jià)格低廉，深受廣大患者認(rèn)可。但目前，我國中藥材質(zhì)量現(xiàn)狀還不容樂觀，特別在我省，由于中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)水平偏低，道地中藥材及飲片質(zhì)量失控現(xiàn)象也比較嚴(yán)重，不能有效地控制其質(zhì)量，對廣泛推廣種植帶來了滯后。所以，只有提升了中藥材及中藥飲片的檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，才能從源頭上更好地控制中藥材及飲片的質(zhì)量，起到推動我國中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)鏈的持續(xù)發(fā)展的作用。

原《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[3](2009年版)童子益母草標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下僅有性狀。為了進(jìn)一步控制該藥材的質(zhì)量，本標(biāo)準(zhǔn)增加了藥材粉末鑒別、薄層鑒別、水分、總灰分、浸出物，并采用 HPLC-ELSD法測定了童子益母草中鹽酸水蘇堿。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);LT-Ⅱ蒸發(fā)光散射檢測器(日本島津公司)；TLC Visualizer薄層成像系統(tǒng)(天津大學(xué)無線電精密儀器廠)；鼓風(fēng)干燥箱( 北京科偉永新儀器有限公司)；PH100顯微成像系統(tǒng)(鳳凰光學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

乙腈為色譜純；其它化學(xué)試劑均為分析純；水為純化水；鹽酸水蘇堿批號110712-201312，含量為99.4%，來源：中國食品藥品檢定研究院；童子益母草10個(gè)批次(產(chǎn)地：甘肅河西地區(qū)三個(gè)不同種植地)。

2 方法與結(jié)果

參照《中國藥典》2015年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)資料，確定提升標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目進(jìn)行研究。

2.1 鑒別

參照《常用中藥鑒定大全》[4]益母草項(xiàng)下粉末鑒別及《中國藥典》2015年版一部[1]益母草項(xiàng)下薄層色譜鑒別方法。

2.1.1 粉末顯微鑒別

(1)非腺毛較多。非腺毛1～4細(xì)胞。大多向一側(cè)偏彎，完整者35～115 μm，頂端細(xì)胞約占全長的1/2～2/3，直徑8～25 μm，壁厚2～10 μm，表面有細(xì)小疣狀突起。(2)腺麟稀少。頂面觀類圓形或橢圓形，直徑33～50 μm，柄極短。(3)小腺毛頭部1～4個(gè)細(xì)胞，側(cè)面觀類圓形，微扁，直徑18～27 μm，柄短，1～2個(gè)細(xì)胞。(4)葉片表皮細(xì)胞呈多角型，垂周壁平直。(5)草酸鈣針晶細(xì)小存在于葉肉細(xì)胞中，直徑3～17 μm。(6)草酸鈣方晶呈方形、菱形或多面體，直徑3～15 μm。(7)導(dǎo)管以螺紋導(dǎo)管為主，也可見梯紋、網(wǎng)紋及具緣紋孔導(dǎo)管。見圖1。

2.1.2 TLC鑒別

取鹽酸水蘇堿項(xiàng)下的供試品溶液10 mL，蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，離心，取上清液作為供試品溶液。另取鹽酸水蘇堿對照品，加無水乙醇使溶解(制成每1 mL含1 mg的溶液)，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)為展開劑，展開，取出 ，晾干，在 105℃加熱15 min,放冷，噴以稀碘化鉍鉀試液-三氯化鐵試液(10∶1)混合溶液至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

注:1、7、12為鹽酸水蘇堿對照品，2、3、4、5、6、8、9、10、11為樣品圖2 薄層色譜圖

2.2 檢查

參照《中國藥典》2015年版一部[1]益母草項(xiàng)下水分(干燥法)、總灰分測定方法,對10批不同種植地樣品進(jìn)行了測定。

2.2.1 水分測定結(jié)果

見表1。

2.2.2 總灰分測定結(jié)果

見表2。

2.3 浸出物測定

參照《中國藥典》2015年版一部[1]益母草項(xiàng)下浸出物測定方法,對10批不同種植地樣品進(jìn)行了測定。見表3。

表1 10批不同種植地童子益母草水分測定結(jié)果(%)

表2 10批不同種植地童子益母草總灰分測定結(jié)果(%)

3 含量測定

參照《中國藥典》2015年版一部[1]益母草項(xiàng)下“鹽酸水蘇堿”測定方法,對10批不同種植地樣品進(jìn)行了測定。

表3 10批不同種植地童子益母草浸出物測定結(jié)果(%)

3.1 色譜分析條件

色譜柱為Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-0.2%冰醋酸溶液(80∶20)為流動相；流速1.0 mL/min；柱溫 ：30℃；蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度：45℃。理論板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

3.2 對照品、樣品溶液制備

3.2.1 對照品溶液制備

鹽酸水蘇堿，批號110712-201312，來源：中國食品藥品檢定研究院，含量99.4%。精密稱取鹽酸水蘇堿對照品12.75 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.2.2 樣品溶液制備

取本品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇 25 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。對照品和樣品的高效液相色譜圖，見圖3。

圖3 鹽酸水蘇堿高效液相色譜圖

圖4 樣品高效液相色譜圖

3.3 線性關(guān)系

分別精密吸取上述對照品溶液5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜峰峰面積。以峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)，對照品進(jìn)樣量的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=1.263 5x+5.199，r=0.999 9，線性范圍為2.5～12.7 μg。

3.4 精密度試驗(yàn)

取上述對照品溶液(鹽酸水蘇堿濃度為0.51 mg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，其RSD為0.51%(n=6) 。表明儀器精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜峰峰面積，其RSD為0.87%(n=6)。說明供試品溶液中鹽酸水蘇堿在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品精密稱取6份，按上述測定方法。平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜峰峰面積，其RSD為0.82%(n=6)。

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知含量的童子益母草供試品6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入上述對照品溶液 1 mL(0.5 mg)，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)方法制備供試品溶液 ，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰峰面積，并計(jì)算回收率。平均回收率為102.76%，RSD為1.41%。見表4。

表4 鹽酸水蘇堿回收率測定結(jié)果

3.8 樣品的測定

取樣品照“3．2．2”項(xiàng)下方法制備供試液，進(jìn)樣10 μL測定 ，照外標(biāo)法 (峰面積 )計(jì)算含量，結(jié)果見表5。

表5 10批不同種植地童子益母草鹽酸水蘇堿測定結(jié)果(%)

4 討論

實(shí)驗(yàn)采集的三個(gè)不同產(chǎn)地的10批樣品都是在甘肅省河西地區(qū)人工種植的，擬在原《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2009年版)上增加的項(xiàng)目均參照《中國藥典》2015年版一部益母草項(xiàng)下方法，檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)果真實(shí)。通過大量實(shí)驗(yàn)表明：童子益母草的藥用部位雖然主要是基生葉，但其鑒別、檢查、浸出物及含量測定的結(jié)果均達(dá)到了《中國藥典》2015年版一部“益母草”項(xiàng)下的規(guī)定限度；特別是鹽酸水蘇堿的含量超出藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定5倍以上，具有良好的線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性，方法簡便，且可操作性強(qiáng)，為更好地控制甘肅省種植童子益母草質(zhì)量提供了檢驗(yàn)檢測方法，是提升中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要依據(jù)，本次標(biāo)準(zhǔn)提升為進(jìn)一步研究童子益母草奠定了基礎(chǔ)。