miRNA-223靶向FoxO3抑制肺結(jié)核大鼠巨噬細(xì)胞凋亡研究

洪愛玲 朱海燕 何貴清 蘇菲菲

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一類嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。結(jié)核分枝桿菌是一種兼性巨噬細(xì)胞寄生菌[1-2]，感染人體后首先寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)。巨噬細(xì)胞凋亡后，連細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌一起被清除[3]。而后，凋亡的巨噬細(xì)胞激活臨近的未被寄生的巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體巨噬細(xì)胞對致病菌的殺傷能力[4]。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜上會(huì)出現(xiàn)一些異常的蛋白等標(biāo)志物，鄰近的巨噬細(xì)胞更容易將其當(dāng)成抗體，從而對其吞噬清除。機(jī)體清除結(jié)核分枝桿菌伴隨著細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的異常蛋白又會(huì)對機(jī)體造成影響。因此，找到既可抑制細(xì)胞凋亡又可清除結(jié)核分枝桿菌的方法意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染人肺部巨噬細(xì)胞達(dá)到一定程度以后，TNF-α可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的外源性凋亡；巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）作為一種促炎癥細(xì)胞因子，可抑制結(jié)核分枝桿菌的生長繁殖；叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3（FoxO3）是細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，可阻遏細(xì)胞周期。miRNA與肺結(jié)核的關(guān)系研究已有報(bào)道，但控制細(xì)胞凋亡的miRNA-223與肺結(jié)核的關(guān)系研究卻不多見。本研究通過建立肺結(jié)核大鼠模型，采用治療肺結(jié)核的藥物異煙肼喂養(yǎng)，以上述因子為基礎(chǔ)，探討影響巨噬細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因及相應(yīng)通路蛋白，以期為研究抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)殺死結(jié)核分枝桿菌提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料 成熟雌性SD大鼠60只，體重184～273（221.5±1.4）g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。異煙肼（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，片劑，規(guī)格2ml∶0.1g）；TAE溶液（上海西唐生物科技有限公司）；瓊脂糖、TBST溶液（上海徠創(chuàng)生物科技有限公司）；TNF-α抗體、MIF抗體、β-actin（美國 Sigma公司）；PBS、細(xì)胞裂解液（武漢博士德生物科技有限公司）；RT-PCR引物由北京奧科生物公司合成。電泳儀（美國Bio-Rad公司）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建 將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、給藥組，每組20只。正常組大鼠尾靜脈注射0.2ml 0.9%氯化鈉注射液。模型組和給藥組大鼠尾靜脈注射由結(jié)核患者痰液中分離的結(jié)核分枝桿菌（該桿菌已按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程驗(yàn)證為結(jié)核分枝桿菌，取分裂旺盛的模型菌，用0.9%氯化鈉溶液溶解，每只大鼠注射0.2ml細(xì)菌懸液）。造模成功后，給藥組大鼠隔日一次性灌胃12 mg/ml異煙肼藥液1ml至造模第30天。監(jiān)測各組大鼠造模第1、15、30天的體重變化。造模第30天時(shí)，以頸椎脫臼法處死各組大鼠，留取肺組織，委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù) 取每只大鼠全部左肺組織，加入2ml 0.9%氯化鈉注射液后研磨成勻漿，再取組織液加等體積4%硫酸消化15min后，加入2.5mol NaOH調(diào)整至pH 7.0左右，接種于斜面培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)5周，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)。

1.2.3 大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法。將×50的TAE溶液稀釋為×1的TAE溶液作為溶劑，稱取0.5g瓊脂糖，加入到TAE溶液中；于微波爐中加熱煮沸，后加入4μl核酸染料，搖晃混勻。將瓊脂糖凝膠水平放入電泳槽，依次加入5μl的 DNA Maker（β-actin）及 miRNA-223、FoxO3 PCR 引物（表1），拍照留存。以β-actin為內(nèi)參，分析目的基因條帶灰度值。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。取每只大鼠全部右肺組織，用PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液在混勻機(jī)下冰浴破碎，于12 000r/min離心機(jī)中4℃離心15min，收集上清液于-80℃下凍存，使用時(shí)沸水浴煮沸5min，4℃保存。把NC膜放入平皿，后在容器中添加脫脂奶粉并在搖床上暗處封閉0.5～1.5 h。棄去奶粉，取出硝酸纖維素（NC）膜置于TBST溶液中洗滌3次。洗滌以后加入TNF-α、MIF一抗，在4℃下孵育過夜。NC膜于第2天取出，將膜放于TBST溶液中洗滌4次后加入二抗孵育，將配置好的顯色液（a液和b液按1∶1的比例現(xiàn)用現(xiàn)配）滴加覆蓋于NC膜上，約1ml從右至左緩慢滴加，后于暗室中膠片沖洗，掃描留存。以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白條帶灰度值。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較3組大鼠（1）造模第1、15、30天體重；（2）肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)；（3）肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA 表達(dá)水平；（4）肺組織 TNF-α、MIF蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.1統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠造模第1、15、30天體重比較 見表2。

表2 3組大鼠造模第1、15、30天體重比較（g）

由表2可見，造模第1天，3組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模第15、30天，3組大鼠體重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且正常組＞給藥組＞模型組（均P＜0.05）。

2.2 3組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)比較 見表3。

表3 3組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)比較

由表3可見，3組大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且正常組＜給藥組＜模型組（均P＜0.05）。

2.3 3組大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達(dá)水平比較 見表4。

表4 3組大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達(dá)水平比較

由表4可見，3組大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與正常組和給藥組比較，模型組大鼠肺組織miRNA-223表達(dá)水平降低，F(xiàn)oxO3 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而給藥組與正常組大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.4 3組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達(dá)水平比較見圖 1、表 5。

圖1 3組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達(dá)電泳圖

表5 3組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達(dá)水平比較

由圖1、表5可見，3組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05），給藥組大鼠肺組織MIF蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05）。

3 討論

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性極強(qiáng)的疾病，且致死率較高。結(jié)核分枝桿菌是一類寄居于巨噬細(xì)胞中的寄生菌，不能獨(dú)自存活于人體內(nèi)，當(dāng)巨噬細(xì)胞被寄生以后發(fā)生凋亡，而后激活周圍的未被感染的巨噬細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，造模第1天，3組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而造模第15、30天，正常組大鼠體重＞給藥組大鼠體重＞模型組大鼠體重。且喂養(yǎng)中觀察到給藥組大鼠結(jié)核病整體癥狀較模型組輕很多，接近正常組，行動(dòng)略緩慢，毛發(fā)略顯粗糙，有一定光澤，反應(yīng)也與正常鼠很接近，說明經(jīng)過異煙肼治療，可以使患病大鼠的癥狀減輕。

結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)可直接反映結(jié)核病的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠肺組織體外培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)明顯高于正常組，正常組無結(jié)核分枝桿菌生長。給藥組與模型組相比，未見或少見結(jié)核分枝桿菌生長。這說明經(jīng)過異煙肼治療以后患病大鼠的病癥明顯減輕，結(jié)核治療效果明顯。

TNF-α是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的急性炎癥細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核分枝桿菌感染人肺部巨噬細(xì)胞達(dá)到一定程度以后，會(huì)引起巨噬細(xì)胞的外源性凋亡，這一凋亡已被證實(shí)是由TNF-α介導(dǎo)的，沒有被感染的巨噬細(xì)胞無論在分泌TNF-α的水平上還是對TNF-α的敏感度上都低于被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞，過量的TNF-α可以激活TNF受體，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-6]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達(dá)水平均明顯高于給藥組、正常組，這說明大鼠患病程度和TNF-α表達(dá)水平有關(guān)，而異煙肼治療可以降低TNF-α表達(dá)水平，此結(jié)果也為監(jiān)測結(jié)核病的嚴(yán)重程度提供可能的生物標(biāo)志物。

miRNA與肺結(jié)核的關(guān)系研究已有報(bào)道[7-8]，miRNA可作為促進(jìn)或抑制癌癥的因子，調(diào)控細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核病的發(fā)生會(huì)影響miRNA-223的表達(dá)水平。模型組大鼠肺組織miRNA-223表達(dá)水平明顯低于正常組，而給藥組大鼠肺組織miRNA-223表達(dá)水平高于模型組。

Fox是細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，激活的FoxO3可以調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而阻遏細(xì)胞周期[11-12]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠肺組織FoxO3表達(dá)水平明顯高于正常組，說明結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞的凋亡是通過FoxO3途徑；在給予異煙肼治療后，F(xiàn)oxO3表達(dá)水平明顯降低，基本接近正常水平。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建大鼠肺結(jié)核模型，分析大鼠患病期間各指標(biāo)變化，結(jié)果顯示，模型組大鼠體重減輕，而給藥組大鼠癥狀相對不明顯。且本研究結(jié)果提示，異煙肼治療可上調(diào)肺結(jié)核大鼠肺組織miRNA-223的表達(dá)，下調(diào)FoxO3的表達(dá)。由此推測miRNA-223或通過靶向作用于FoxO3抑制相關(guān)凋亡基因及蛋白的表達(dá)，從而抑制肺結(jié)核大鼠巨噬細(xì)胞凋亡。