PTEN-Long對肝癌細胞的抑制作用研究

張謝 譚麟 林劍 毛琦淇 李宏

我國HBV攜帶者約9 000萬，每年新發(fā)肝癌病例約32萬，占全球55%；60歲以下男性肝癌發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位，肝癌患者5年生存率不足10%，形勢不容樂觀[1-2]。目前，手術是肝癌首選的治療方法，但是手術治療主要針對早期肝癌患者；對于晚期及術后復發(fā)患者，探尋新的治療方法使其延長生存時間、提高生活質量已十分迫切。2013年Hopkins等[3]發(fā)現了第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）基因編碼PTEN的一種變形體，命名為PTEN-Long，其與PTEN高度同源。PTEN-Long在PTEN的N端增加了173個氨基酸，且在進化上高度保守，是新發(fā)現的一個具有磷酸酶活性的抑癌蛋白[2-5]。PTEN-Long的存在依賴于PTEN的表達，且表達水平和PTEN成正比[6]。本研究擬從PTEN-Long表達水平較高的人腎上皮293T細胞溶解產物中分離純化PTEN-Long，觀察其對肝癌細胞的抑制作用，以及對肝癌移植小鼠的腫瘤抑制作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗動物 129S1/SvlmJ小鼠40只，SPF級，體重18～22g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，在寧波大學動物實驗中心分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 主要材料 人腎上皮293T細胞及肝癌HepG2、HUH6、FOCUS細胞（中國科學院上海細胞庫），DMEM培養(yǎng)基（美國 Gibico公司，批號：10569010），FBS（美國Gibico公司，批號：10091130），PTEN（138G6）抗體（美國Cell Signaling公司，批號：9559），鼠抗兔二抗（美國Santa Cruz公司，批號：sc-2358），BCA 蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0012），單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MTS法，美國Promega公司，批號：G3580），脂質體2000轉染試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：11668）；pcDNA3.1-PTEN-Long質粒由美國紐約斯隆癌癥中心贈送。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機（micro21R型，美國Thermo Fisher公司），超純水（Direct-Q3型，美國Millipore公司），酶標儀（680型，美國 Bio-Rad公司），細胞培養(yǎng)箱（BB15型，美國Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 293T細胞和肝癌 HepG2、HUH6、FOCUS細胞用含10%FBS、雙抗（50mg/ml青霉素+50mg/ml鏈霉素）的高糖 DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數生長期細胞進行實驗。2×105個細胞/3ml接種于直徑100mm培養(yǎng)皿中，待其貼壁長到全皿的80%～90%時收集細胞。

1.2.2 細胞轉染 按照脂質體2000轉染試劑盒說明書將pcDNA3.1-PTEN-Long質粒轉染進入293T細胞。轉染前1d，細胞鋪板于直徑100mm培養(yǎng)皿中，使其轉染密度約為90%。轉染試劑用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，細胞也用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基孵育。轉染6h后，轉染培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基（包含10%FBS和50mg/ml青霉素+50mg/ml鏈霉素）。細胞轉染48h后，提取蛋白。

1.2.3 PTEN-Long分離純化 將轉染pcDNA3.1-PTENLong質粒后的293T細胞用1～2ml PBS洗滌3次，加入3ml 0.25%胰酶-EDTA進行消化，血清終止消化；將細胞液移到15ml無菌離心管中，1 000r/min離心3min；然后重新懸浮在含1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的細胞裂解液中。懸浮液經Dounce型組織碾磨器碾磨數次后置于冰上孵育30min，使細胞充分裂解；裂解液離心10min（15 000r/min），棄去上清液。將沉淀重新懸浮在含0.5mol/L NaCl的細胞裂解液中碾磨數次，后置于冰上孵育30min；裂解液離心10min（15 000r/min），留取上清液。在上清液中加入40%的硫酸銨溶液直至PTEN-Long沉淀，沉淀后的PTEN-Long離心10min（15 000r/min），與未沉淀雜蛋白分離。沉淀中的PTEN-Long用細胞裂解液重新溶解，分別經疏水柱（HIC）、陽離子交換柱（SP）、陰離子交換柱（Q）分離純化，得到純化的PTEN-Long蛋白。

1.2.4 PTEN-Long蛋白表達檢測 經分離純化的PTEN-Long蛋白用Western blot法檢測表達純度。按蛋白裂解液說明書提取蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，蛋白變性后行SDS-PAGE電泳，濕轉到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入3%BSA封閉液，室溫下孵育2h，加入 PTEN（1∶300），4℃封閉過夜，棄一抗，Tris-HCl緩沖液+吐溫（TBST）洗3遍。加入1∶10 000的二抗，室溫孵育2h后，棄二抗，TBST洗3遍，增強化學熒光發(fā)光法顯影，曝光。

1.2.5 肝癌HepG2、HUH6、FOCUS細胞存活情況檢測采用MTS法。分別將HepG2、HUH6、FOCUS細胞懸液以每孔 100μl[含（5～8）×103個細胞/ml] 接種于 96 孔板中，并加入終濃度為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40nmol/L 的 PTEN-Long（100μl/孔），并設空白對照組，均設置3個復孔。每孔加入MTS液 10μl，孵育4h后測定490nm吸光度值，以此反映PTEN-Long對細胞存活的影響。

1.2.6 動物模型建立與分組 將40只小鼠按隨機數字表法分成PTEN-Long組和對照組，每組20只。消毒小鼠大腿根部皮膚，并在消毒部位接種0.2ml含細胞數5×105個的肝癌HepG2（兩組分別各 10只）或 HUH6（兩組分別各10只）細胞懸液。對照組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.2ml，1次/d；PTEN-Long組小鼠腹腔注射PTEN-Long（劑量4mg/kg體重，溶于0.2ml 0.9%氯化鈉注射液中），1次/d。用游標卡尺測量各組小鼠腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2ab2（a、b分別表示長徑、短徑）。

1.3 觀察指標 （1）PTEN-Long分離純化結果；（2）PTEN-Long對肝癌 HepG2、HUH6、FOCUS 細胞的抑制作用；（3）比較PTEN-Long組與對照組小鼠腫瘤體積。

1.4 統計學處理 應用GraphPad 5.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN-Long分離純化結果 Western blot法檢測分離純化后的PTEN-Long蛋白（圖1），純化后PTENLong蛋白純度較高，約80%。

圖1 PTEN-Long分離純化結果電泳圖

2.2 PTEN-Long 對肝癌 HepG2、HUH6、FOCUS 細胞抑制作用觀察結果 與空白對照組比較，5nmol/L濃度以上的PTEN-Long對肝癌HepG2、HUH6細胞有明顯的抑制作用，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而PTEN-Long對肝癌FOCUS細胞無明顯抑制作用，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。且PTEN-Long對肝癌HepG2、HUH6細胞的半抑制濃度分別為12、26nmol/L（圖2）。

圖2 PTEN-Long對肝癌 HepG2、HUH6、FOCUS細胞抑制作用比較（*P＜0.05）

2.3 PTEN-Long組與對照組小鼠腫瘤體積比較 與對照組相比，從14d開始，PTEN-Long組肝癌HepG2細胞移植小鼠腫瘤體積明顯較?。▓D3），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與對照組相比，從12d開始，PTENLong組肝癌HUH6細胞移植小鼠腫瘤體積明顯變小（圖4），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

最新統計數據顯示，全球肝癌5年生存率為5%～30%，而我國大陸地區(qū)肝癌5年生存率僅從2000至2004年時的11.7%上升到2010至2014年的14.1%，生存率仍不樂觀[7]。故深入研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋求新的肝癌靶向治療藥物，對于延緩疾病進程、降低病死率有著重要的臨床意義。

PTEN基因在人類很多癌癥中發(fā)生突變或缺失，且?guī)缀跻话氲母伟┗颊叽嬖赑TEN基因的缺失[8-9]。HBV感染的肝癌患者PTEN蛋白水平明顯升高，但AKT下調，提示PTEN參與了HBV中不受控制的或增加的蛋白表達[10]。PTEN低表達的肝癌患者術后疾病無進展時間與總生存率明顯下降，且腫瘤體積更大，甲胎蛋白（AFP）水平更高，這說明PTEN與肝癌的發(fā)展和預后有明顯的臨床相關性[11]。因此，臨床對PTEN用于癌癥治療抱有很高期望，認為通過間接增加PTEN在細胞內的表達，或是利用腺病毒等載體將PTEN的cDNA重新引入有PTEN基因缺陷的患者體內，可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12-13]。

2013年發(fā)現的一種新PTEN變體PTEN-Long，已被鑒定為從PTEN mRNA的5′UTR中的另一翻譯起始密碼子（CUG）翻譯，在N端包含比PTEN額外的173個氨基酸，而在N端多出來的結構能夠協助PTENLong 進入細胞，從而發(fā)揮作用[2，6，14]。本課題組前期研究發(fā)現，PTEN-Long可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路，抑制腫瘤的發(fā)生[15]。有研究顯示，與PTEN相比，PTEN-Long以外源蛋白形式發(fā)揮抗病毒作用，且PTEN-Long增強了Ⅰ型IFN和促炎癥細胞因子的反應，提示PTEN-Long與PTEN相比可能具有更多的額外功能[16]。

圖3 PTEN-Long組與對照組小鼠（移植HepG2細胞）腫瘤體積比較（*P＜0.05）

圖4 PTEN-Long組與對照組小鼠（移植HUH6細胞）腫瘤體積比較（*P＜0.05）

本研究通過從經質粒轉染的人腎上皮293T細胞溶解產物中分離純化PTEN-Long，用其干預各類肝癌細胞，發(fā)現PTEN-Long能明顯抑制肝癌細胞生長；且異種移植試驗顯示，PTEN-Long可以抑制肝癌細胞成瘤。這提示PTEN-Long對肝癌細胞起抑制作用，這或為肝癌分子靶向治療提供新思路。