河北省番茄病毒病種類鑒定及分布

張愛紅 楊菲 李希望 邸墊平 苗洪芹 潘陽 孫祥瑞 張尚卿 孫茜

摘要 [目的]鑒定河北省番茄上主要病毒病種類，明確病原和分布。[方法]采用分子生物學(xué)技術(shù)及免疫試紙條技術(shù)，對2016—2018年采自河北省8個(gè)縣市18個(gè)番茄主產(chǎn)區(qū)的番茄樣品進(jìn)行病毒病種類鑒定。[結(jié)果]采集的番茄樣品中共檢出3種病毒，分別為番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus）、番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus）、番茄花葉病毒（tomato mosaic virus）。其中TYLCV是目前河北省危害最嚴(yán)重、分布最廣泛的一種病毒，各調(diào)查地區(qū)均能檢出，檢出率為63.29%，其次為ToCV，檢出率為17.19%，田間主要表現(xiàn)與番茄黃化曲葉病毒混合侵染;ToMV檢出率僅為0.09%，為零星發(fā)生。[結(jié)論]河北省番茄病毒病的主要種類為粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒。

關(guān)鍵詞 番茄;病毒病;鑒定;分布

中圖分類號 S436.412.1+1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0139-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.041

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract [Objective] To determine the pathogens and distribution of tomato viral diseases in Hebei Province. [Method] In 2016-2018， a total of 346 infected tomato plant samples were collected from 18 main production areas of tomato in Hebei Province. Molecular biology and immunostrip techniques were used to detect the pathogens of tomato samples . [Result] Three kinds of tomato viruses were identified in the samples， they were tomato yellow leaf curl virus （TYLCV），tomato chlorosis virus （ToCV） and tomato mosaic virus （ToMV）. TYLCV could be detected at every sampling site with the highest detection rate of 63.29%. The detection rate of ToCV was 17.19%， and all the positive samples were mixinfected with TYLCV. ToMV occurred sporadically in Hebei Province with a detection rate of only 0.09%. [Conclusion] Three virus were detected， TYLCV and ToCV which transmitted by whiteflies were the main types of tomato viruses in Hebei Province.

Key words Tomato;Virus disease;Identification;Distribution

作者簡介 張愛紅（1981—），女，河北保定人，副研究員，碩士，從事植物病毒研究。*通信作者：

邸墊平，研究員，博士，從事植物病毒研究;苗洪芹，研究員，碩士，從事植物病毒研究。

收稿日期 2019-02-21

番茄是一種種植廣泛的蔬菜作物。目前，已發(fā)現(xiàn)的番茄病毒種類約40種，其中在我國發(fā)生并報(bào)道的病毒病有18種，較常見的包括煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus）等 [1-2]。在不同環(huán)境、栽培模式的影響下，番茄病毒病的種類有所差別，且各地的優(yōu)勢病毒種類會(huì)隨環(huán)境及種植模式的改變而發(fā)生變化。20世紀(jì)70年代，我國番茄病毒病以煙草花葉病毒（TMV）為絕對優(yōu)勢種群，黃瓜花葉病毒（CMV）發(fā)生相對較輕[1]。20世紀(jì)80年代以來，隨著大面積推廣抗TMV品種，我國部分地區(qū)田間番茄病毒種群發(fā)生變化[2]。20世紀(jì)90年代，隨著氣候變化及種植模式的改變，煙粉虱傳播的病毒病在全球范圍內(nèi)暴發(fā)、擴(kuò)展和蔓延。2008年，粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus）在河北省首次被發(fā)現(xiàn)[3]，2014年番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus）在河北省檢出[4]。番茄病毒病病原種類較多，田間發(fā)病癥狀較為復(fù)雜，不同的病毒傳播方式不同，因而防治的關(guān)鍵點(diǎn)也不同。近年來，河北省番茄種植面積不斷擴(kuò)大，因此，明確不同地區(qū)番茄病毒病的病原種類對控制病害的發(fā)生和流行具有重要意義。筆者于2016—2018年對河北省番茄主產(chǎn)區(qū)保護(hù)地番茄病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行較為系統(tǒng)的調(diào)查，以期為番茄病毒病癥狀識別、防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 番茄病毒病的調(diào)查及樣品采集

2016年1月至2018年8月，在河北省石家莊高邑、藁城、欒城、保定定州、清苑、定興、博野、雄安新區(qū)、唐山灤南、豐南、樂亭、滄州獻(xiàn)縣、肅寧、衡水饒陽、邯鄲永年、肥鄉(xiāng)、邢臺(tái)臨城、邢臺(tái)市區(qū)18個(gè)縣區(qū)調(diào)查番茄病毒病發(fā)生情況，采集表現(xiàn)黃化、褪綠、卷曲、花葉、矮化等癥狀的葉片，分別裝在采集袋中，標(biāo)明采集時(shí)間、地點(diǎn)、品種、癥狀，保存于-70 ℃冰箱中待測。以溫室培養(yǎng)的網(wǎng)箱內(nèi)健康的番茄葉片作為陰性對照。

1.2 總RNA和DNA的提取、RT-PCR和PCR

分別根據(jù)試劑盒說明從番茄葉片樣品中提取總RNA、DNA。TMV、CMV、ToMV、ToCV的檢測采用一步法RT-PCR方法，TYLCV的檢測采用PCR方法，檢測過程參照試劑盒說明書進(jìn)行，病毒的引物信息見表1[5-8]。擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳中檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并用G：BOX SYNGENE全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，取部分?jǐn)U增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序。DNA、RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，一步法RT-PCR反應(yīng)試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)公司。

1.3 番茄斑萎病毒的免疫試紙條檢測

對表現(xiàn)卷葉、黑斑、環(huán)斑等癥狀的樣品，應(yīng)用免疫試紙條方法進(jìn)行TSWV的檢測。番茄斑萎病毒試紙條購自北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司，檢測步驟參照試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄病毒病田間癥狀

2016—2018年調(diào)查河北省番茄病毒病發(fā)生情況，樣品采集區(qū)番茄病毒病發(fā)病較嚴(yán)重，田間癥狀大部分表現(xiàn)為植株矮化，葉片邊緣黃化，沿葉脈褪綠（圖1a、b）、葉片上卷（圖1c），個(gè)別植株矮化不明顯，葉片表現(xiàn)褪綠、花葉（圖1d）。

2.2 侵染河北省番茄的主要病毒種類

對采自18個(gè)番茄主產(chǎn)區(qū)的346份樣品進(jìn)行PCR及RT-PCR 檢測，結(jié)果表明，大部分樣品中能擴(kuò)增到約304 bp的特異性條帶，經(jīng)測序比對結(jié)果顯示，與GenBank中TYLCV序列的相似性高達(dá)99.9%，確定該序列為TYLCV的片段;部分樣品能擴(kuò)增出463 bp的特異性條帶，經(jīng)測序比對結(jié)果顯示，與GenBank中ToCV序列的相似性高達(dá)99.48%，確定該序列為ToCV片段;僅博野采集的1份樣品中檢測到565 bp的特異性條帶，經(jīng)測序比對結(jié)果顯示，與GenBank中ToMV序列的相似性高達(dá)99.8%，確定該序列為ToMV片段。

免疫試紙條檢測結(jié)果表明，該次檢測樣品中暫未檢測到TSWV的陽性樣品。

以上結(jié)果表明，該次采樣共檢測出3種番茄病毒，分別為番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）、番茄褪綠病毒（ToCV）、番茄花葉病毒（ToMV），暫未檢測到煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）。其中TYLCV的檢出率最高，為63.29%，其次為ToCV，檢出率為17.19%，ToMV檢出率僅為0.09%（表2）。

2.3 河北省番茄病毒病發(fā)生和分布及復(fù)合侵染

在河北省8縣市18個(gè)地區(qū)采集的樣品中，各調(diào)查點(diǎn)均能檢測到TYLCV，檢出率最高為100%，最低為33.3%;除石家莊欒城、唐山灤南、樂亭、永年外，其他14個(gè)地區(qū)樣品中均檢測到ToCV，最高檢出率為50%，最低4.17%，所有ToCV均與TYLCV復(fù)合侵染，暫未發(fā)現(xiàn)ToCV單獨(dú)侵染的樣品。該次檢測到的ToMV為單獨(dú)侵染，僅在保定博野發(fā)現(xiàn)1株陽性樣品，說明ToMV在河北省發(fā)生較輕，僅為零星發(fā)生。

3 結(jié)論與討論

該研究對采自河北省8個(gè)縣市18個(gè)番茄主產(chǎn)區(qū)的346份樣品進(jìn)行了6種番茄病毒種類的檢測，發(fā)現(xiàn)目前河北省番茄主產(chǎn)區(qū)主要存在3種病毒，分別為TYLCV、ToCV和ToMV，其中TYLCV是分布最廣、發(fā)生最嚴(yán)重的一種病毒病，田間ToCV主要表現(xiàn)為與TYLCV混合侵染，在不同地區(qū)的發(fā)病率差異較大，可能與種苗來源有關(guān)。TYLCV和ToCV通過煙粉虱傳播，因此目前番茄病毒病的防治重點(diǎn)應(yīng)在于控制煙粉虱的暴發(fā)與流行，并加強(qiáng)種苗檢疫，減少病毒初侵染源。

該次檢測樣品中未檢測到TMV、CMV，ToMV的檢出率僅為0.09%，為零星發(fā)生，考慮其原因可能有2個(gè)：①以上3種病毒的田間癥狀主要表現(xiàn)為花葉、蕨葉等癥狀，在生產(chǎn)過程中，農(nóng)民對這種癥狀比較容易辨認(rèn)，一旦發(fā)病會(huì)立即拔除，降低了此類病害在番茄產(chǎn)區(qū)的流行;②目前大部分主推的番茄品種對TMV、CMV、ToMV的抗性較好，隨著這些抗病品種的應(yīng)用，這類病毒的發(fā)生率處于較低水平。

除了以上幾種病毒外，TSWV也是該次檢測的重點(diǎn)。TSWV可以侵染茄科、葫蘆科、豆科、菊科等多種植物，是番茄上一種重要的病毒，目前云南[9]、廣州[10]、北京[11]、山東[12]、寧夏[13]等地已有報(bào)道。受采樣范圍所限，該次調(diào)查中暫未檢測到該病毒在河北省發(fā)生。鑒于各地區(qū)種子、種苗調(diào)運(yùn)日益頻繁，該病毒的傳播介體西花薊馬寄主廣泛，繁殖力強(qiáng)，田間防治難以有效控制，TSWV傳播范圍有可能進(jìn)一步擴(kuò)大，因此還應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測力度，警惕該病毒在河北省的發(fā)生。

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