玉米中黃曲霉毒素B1測定的不確定度評定

王春艷，聶緒恒，袁毅，蔣雁，向西

（1.貴州省糧油產品質量監(jiān)督檢驗站，貴州 貴陽 550003；2.云南省糧油科學研究院，云南 昆明 650000）

黃曲霉毒素可以由黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽溜曲霉4 種曲霉菌產生，是一組化學結構類似的二呋喃香豆素的衍生化合物[1]。黃曲霉毒素B1是已知的最強致癌物之一[2-3]，對人和動物具有極強的致癌、致畸、致突變作用，并且對肝臟的急性毒性也很高[2-7]。糧食在種植、收獲、儲存、運輸過程中如保存不當極易受潮霉變而污染黃曲霉毒素[8]。中華人民共和國國家標準GB 2761-2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》[9]對食品中真菌毒素已明確限量規(guī)定。

不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯系的參數[10]。一個完整的定量分析結果應該包含測量值（表示被測量集中性的參數又稱最優(yōu)估計值）和測量不確定度（表示被測量分散性的參數）兩個指標[11-13]。不確定度是對測量結果質量的定量評定，測量結果是否有用，很大程度上取決于不確定度的大小，所以測量結果必須有不確定度說明時才是完整和有意義的[14]。目前，已有大量的研究文獻對高效液相色譜法測定食品中常見的真菌毒素不確定度進行評定[15-20]，而采用超高效液相色譜法-無衍生器（大流通池直接檢測）-熒光檢測器測定糧食中真菌毒素不確定度評定的文獻資料較少，試驗采用GB 5009.22-2016[21]《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B 和G 族的測定》測定玉米中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的含量，根據JJF1059.1-2012[11]《測量不確定度評定與表示》要求及CNAS-GL006-2018[10]《化學分析中不確定度的評估指南》，評定試驗過程引入的不確定度，對測定過程中產生的不確定度分量進行計算，計算出合成標準不確定度及各分量的相對貢獻[8]，以期為評價測定結果的準確性和可靠性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米樣品：貴州省儲備糧管理有限公司；AFB1標準品（CAS：1162-65-8，純度 99%，25.01μg/mL，不確定度為±0.03 μg/mL）：新加坡 Pribolab 公司；甲醇、乙腈均為色譜純：美國Tedia 公司；AFB1免疫親和柱：江蘇蘇微生物研究有限公司；玻璃纖維濾紙：英國Whatman 公司；屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀（配大體積流通池熒光檢測器）：美國Waters 公司；LT202E型分析天平：常熟市天量儀器有限責任公司；HY-4 型多用調速振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；N-EVAP111 型氮吹儀：美國Organomation 公司；S0200 漩渦振蕩器：美國萊伯特公司；3310 型實驗磨：瑞典 Perten 公司；Researchplus 手動移液器：德國eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

參照GB5009.22-2016[21]“第三法高效液相色譜-柱后衍生法”大流通池直接檢測，并結合江蘇蘇微生物研究有限公司提供的黃曲霉毒素B1免疫親和柱說明書進行：將玉米樣品清雜后，磨粉機粉碎，準確稱取5.00 g 試樣于150 mL 具塞錐形瓶中，加入1.0 g 氯化鈉及25 mL 70%的甲醇水溶液，振蕩20 min，用快速定性濾紙過濾，移取15 mL 濾液，用30 mL 水將濾液稀釋混勻，再經玻璃纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液；移取15 mL 上樣液過免疫親和柱，用去離子水淋洗免疫親和柱2 次，每次10 mL，待液體排干后，用1.5 mL 甲醇洗脫。收集全部洗脫液，在50 ℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，用初始流動相復溶定容至1.5 mL，用 0.22 μm 微孔濾膜，待測。

1.3.2 色譜條件

C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫 35 ℃；流動相：A 為水，B 為乙腈-甲醇（50+50）；等度洗脫：洗脫程序為 65%A，洗脫時間 6 min；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長：365 nm；發(fā)射波長：436 nm。

1.3.3 建立數學模型

根據測定原理及方法，樣品中AFB1含量計算見公式[21]（1）：

式中：X 為樣品中 AFB1含量，μg/kg；C 為試樣中AFB1含量，ng/mL；V 為最終甲醇洗脫液體積，mL；W為最終凈化洗脫液所含試樣質量，g；m 為試樣稱取質量，g；V1為樣品和提取液總體積，mL；V2為稀釋用樣品濾液體積，mL；V3為稀釋液體積，mL；V4為通過親和柱的樣品提取液體積，mL。

2 結果與分析

2.1 不確定度的來源分析

根據[10-11]CNAS-GL006-2018《化學分析中不確定度的評估指南》、JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》，從試樣的檢測過程及數學模型分析，玉米中AFB1測定結果的不確定度主要來源有：1）玉米樣品非均勻性因素引入的相對標準不確定度urel（fhom）；2）AFB1標準溶液校準過程帶入的相對標準不確定度urel（cal），包括標準品儲備液濃度引入的相對標準不確定度urel（cs），標準溶液質量濃度Cs 由溫度變動引入的相對標準不確定度urel（C），標準中間液配置urel（V1）和urel（V2）、標準工作液配置引入的相對標準不確定度urel（Vs）；標準工作曲線的擬合產生的相對標準不確定度urel（c）；3）玉米樣品稱量相對標準不確定urel（m）；4）回收率引入的相對標準不確定度玉米樣品處理液定容引入的不確定度urel（V）；6）AFB1含量重復性測量引入的相對標準不確定度urel（ωrep）。根據JJF1059.1-2012[11]，將各分量相對標準不確定度進行合成，得到合成相對標準不確定度計算公式（2）：

2.2 不確定度的評定

2.2.1 由樣品非均勻性因素引入的相對標準不確定度urel（fhom）

由于玉米顆粒較小麥、稻谷大，AFB1在試樣不同籽粒間分布極不均一，通常只有少部分顆粒受到黃曲霉菌污染，但經染的籽粒上卻有較高的AFB1含量，所以感染嚴重的籽粒通?？梢宰笥覝y定結果[22-23]，因此樣品非均勻性引入的不確定度分量應該包含在被測量的計算公式中。為了保證試樣均勻性和檢測結果的代表性，需要大量取樣以制備樣品，主要過程包括混合、粉碎、混勻、縮分等[23-24]。本試驗制樣過程如下：1）將待檢測原糧樣品（約2 kg）至于鐘鼎式分樣器反復混勻分樣10 次；2）分別將單側1/2 樣（約1 kg）再次經鐘鼎式分樣器反復混勻5 次；3）隨機分別取兩側1/4 樣（約0.5 kg）經鐘鼎式分樣器分樣，得到1/8 樣（約0.25 kg）；4）隨機取兩測1/8 樣混合，得到約500 g試樣，經波通水分磨粉碎，裝入比試樣體積大3 倍的自封袋，將自封袋充滿空氣封口合上，手動上下左右搖勻約1 min，即得到待測玉米粉試樣。為了評定該不確定度分量，本試驗從待測玉米粉試樣平行稱取10 份樣品，分別測定含量，測定結果見表1，其不確定度按A類評定。

表1 不同樣品AFB1 含量檢測結果Table 1 Analytical results for the determination of AFB1 in different samples

10 個試樣測定結果平均值X=3.60 μg/kg，標準偏差

因此，含量平均值X 的相對標準不確定度為urel（fhom）=

2.2.2 校準不確定度

校準過程中的不確定度包含兩種不確定因素：一是標準溶液配制的相對標準不確定度，二是標準曲線擬合時帶入的相對標準不確定度。

2.2.2.1 標準溶液配制的相對標準不確定度

1）不同廠家生產的標準物質的純度不同，由其所導致的不確定度也不同，查找AFB1標準物質的出廠證書可以知道其濃度為（25.01±0.03）μg/mL，置信水平為95%，按B 類評定，屬于正態(tài)分布，其標準不確定度u（cs）和相對標準不確定度urel（cs）分別為

2）標準溶液質量濃度Cs 由溫度變動引入的相對標準不確定度

AFB1標準溶液的溶劑為乙腈，20 ℃時乙腈的膨脹系數為 1.37×10-3℃-1，而實驗室的溫度為（20±5）℃，按B 類評定，服從均勻分布，包含因子區(qū)間半寬度為：α（Cs）=5 ℃×1.37×10-3℃-1=6.85×10-3，引入的相對標準不確定度為：

3）中間標準溶液配制的相對標準不確定度：吸取400 μL 黃曲霉毒素 B1標準儲備液（25.01±0.03）μg/mL，用初始流動相定容到10mL 容量瓶，得到濃度為1 μg/mL的標準中間液，配制過程中使用移液器吸取標準儲備液時，會引入一定的不確定度，依據JJG 646-2006[25]移液器檢定規(guī)程中相應的最大允差（maximum permissible errors，MPE），并根據矩形分布計算可以得到

同樣可以根據JJG 196-2006[26]規(guī)程得到，配制過程中使用的 10 mL 容量瓶的允差為±0.020 mL，u（V2）和urel（V2）分別為

4）標準工作液配制的相對標準不確定度：把黃曲霉毒素B1標準中間液1 μg/mL 用初始流動相稀釋得到 0.1、0.5、2、5、10、20 ng/mL 的校準曲線溶液。配制過程中使用了大小不同的移液器，由此產生的不確定度如表2所示，依據JJG 646-2006[25]移液器檢定規(guī)程中應的MPE，計算得到：

綜上可知，標準溶液配制帶入的相對標準不確定度為：

表2 使用不同量程移液器時的不確定度Table 2 Uncertainty in the use of different range pipettes

2.2.2.2 標準工作曲線擬合產生的相對標準不確定度

樣品中AFB1濃度測定過程采用所配制的0.1、0.5、2、5、10、20 ng/mL 的標準工作液，分別取以上 6 種不同質量濃度的標準溶液2 uL 重復測定3 次，得到3次對應的峰面積A1～A3，根據最小二乘法計算，通過Excel 軟件擬合，求得標準工作曲線的一元一次方程A=129 055.5C+8 152.7，結果見表3。

表3 標準曲線結果Table 3 Calibration curve fitting

將得到的6 次樣品峰面積值代入標準曲線方程中，求得6 次測定的平均濃度C=3.74 ng/mL，樣品中AFB1的濃度根據標準曲線求得，而標準曲線的擬合過程中存在著一定的不確定度，其u（c）值為u（c）=式中：s（A）表示標準溶液峰面積殘差的標準差7 419；A 表示標準溶液峰面積；C 表示標準溶液濃度；表示標準溶液的平均濃度ng/mL；Sss表示標準溶液濃度殘差的平方和表示標準溶液的測定次數，本試驗取n=18；P 表示試樣的測定次數，本試驗取P=3。標準曲線的擬合過程中存在的urel（c）值為：

綜上所述，校準過程帶入的不確定度為：

2.2.3 樣品稱量相對標準不確定

用精確至0.01 g 的電子分析天平稱取玉米樣品，稱量過程所引入的不確定度來自天平校準。天平校準的允許誤差極值為±0.01 g，不確定度按B 類評定，服從均勻分布，包含因子稱樣量為5.00 g，則稱量樣品時天平引入的相對標準不確定度：

2.2.4 回收率引入的相對標準不確定度

玉米試樣的前處理包括提取溶劑萃取、過濾、稀釋、凈化、濃縮、復溶等步驟，不確定度的影響因素較多，各環(huán)節(jié)的不確定度難以評定，該不確定度屬A 類評定，利用添加3.0 ug/kg 水平6 次樣品進行平行加標測定，測定的Rec 分別為92.0%、93.5%、89.5%、94.0%、95.0%、94.5%。平均回收率=93.1%，標準偏差SR=2.04%，計算得到分別為：

2.2.5 樣品處理液定容引入的相對標準不確定度

根據JJG 646-2006[25]，5 mL 移液器允許最大誤差為±1.0%，按B 類評定，屬于均勻分布則5 mL移液器的相對標準不確定度：

2.2.6 AFB1含量測量重復性引入的相對標準不確定度urel（ωrep）

重復性引入的不確定度，主要受操作人員的熟練程度及儀器本身性能等因素的影響，并包含了C、V、m測量時的重復性不確定度的分量，該不確定度屬A 類評定[24]。隨機選取2.2.1 節(jié)中AFB1試樣1 進行6 次獨立重復測定，結果分別為 3.78、3.82、3.80、3.82、3.79、3.79 μg/kg，平均值=3.79 μg/kg，標準偏差，計算測定過程中伴隨的隨機效應導致的和urel（ωrep）分別為

2.3 相對合成標準不確定度

由上述各相對標準不確定度合成玉米中AFB1含量測定的相對合成標準不確定度為：

2.4 主要相對標準不確定度分量對相對合成不確定度的貢獻

主要相對標準不確定度分量對相對合成不確定度的貢獻見表4。

表4 主要不確定度分量的相對貢獻Table 4 The relative contribution of uncertainty components

由表4可知，樣品非均勻性引入的不確定度相對貢獻最大，回收率、校準過程、樣品處理液定容等次之，樣品稱量及重復測定引入的相對貢獻最小。

2.5 相對擴展不確定度

試驗玉米中AFB1的含量為3.60 μg/kg，則其標準不確定度為：

在沒有特殊要求的情況下，按照國際慣例，取擴展因子k=2，置信概率p=95%，則AFB1測量結果的相對擴展不確定度為：

因此，高效液相色譜法測定玉米中AFB1含量測量結果可表示為（3.60±0.14）μg/kg，包含因子 k=2，置信概率p=95%。

2.6 討論

從表4各主要不確定度分量的相對貢獻可知，試驗過程中樣品均勻性所引入的不確定度分量（52.08%）最大，黃曲霉毒素B1在樣品中分布不均勻性問題已是客觀存在，提示檢測人員在實際工作中，應該重視真菌毒素的混樣、取樣步驟，同時扦樣人員在入庫扦樣時應注意所扦樣品是否具有代表性，扦樣點少無代表性，扦樣點多增加工作人力，且耗時，對于不同大小糧倉，應扦取多少個樣品點，還有待深入研究。

3 結論

試驗采用超高效液相色譜法測定玉米中AFB1的含量，通過分析和量化各分量相對標準不確定度對測定結果的影響，并對測定結果的不確定度來源和各分量相對貢獻進行比較，得出如下結論。

1）通過計算各分量的標準偏差，得到各分量的相對標準不確定度，得知玉米中AFB1不確定度主要來源于樣品非均勻性，其次是樣品前處理回收率、校準過程及樣品處理液的定容，樣品稱量及重復測定引入的相對標準不確定度貢獻最小。

2）試驗結果的不確定度可表示為（3.60±0.14）μg/kg。在測定過程中，由于真菌毒素在樣品中分布極不均。因此，在樣品制備過程中，顆粒樣品的粉碎和進一步混勻至關重要，檢測為了使檢測結果客觀、真實，檢測人員應多次混勻樣品，平行測定2 個以上樣品，盡量減小由樣品不均勻因素引入的不確定度；同時，檢測人員應嚴格按照規(guī)范配置標準溶液，定期做加標回收試驗，或對質控樣品進行測試，盡可能減少系統(tǒng)和偶然誤差；并定期參加不同單位間的能力比對驗證活動，發(fā)現新問題，解決問題，只有這樣，才能把不確定度控制在可接受的范圍內。