咸豐鲊廣椒中乳酸菌的分離與鑒定及其泡菜發(fā)酵特性評價

鄧風(fēng)，張一涵，羅芳會，趙慧君，郭壯，張振東

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽 441053）

泡菜是一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，可以多種蔬菜為主要原料，經(jīng)過發(fā)酵制成。因其操作簡單，風(fēng)味獨(dú)特，品種多樣，且具有良好的口感而深受大眾的喜愛。在我國，主要以四川泡菜最為出名，其產(chǎn)品銷量位居全國第一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2009年四川泡菜產(chǎn)量就已經(jīng)達(dá)到了120 萬噸，產(chǎn)值90 億元[1]。有研究表明，泡菜中存在著多種乳酸菌，如植物乳桿菌、腸膜狀明株桿菌和短乳桿菌等[2]。乳酸菌不僅是泡菜發(fā)酵中最主要的菌群，還是其獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)的良好來源[3]。

但傳統(tǒng)的泡菜制作工藝由于發(fā)酵周期長，容易產(chǎn)生較多雜菌的原因會導(dǎo)致其在風(fēng)味、口感等品質(zhì)上變差，而通過人工接種菌劑的方式可以增強(qiáng)泡菜中特定乳酸菌的發(fā)酵優(yōu)勢，抑制其他雜菌的生長，增強(qiáng)泡菜品質(zhì)。于是，可以篩選發(fā)酵能力優(yōu)良的乳酸菌，如植物乳桿菌、干酪乳桿菌[4]、戊糖片球菌、腸膜狀明串珠菌[5]等用于泡菜的發(fā)酵制作。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）作為一種常見的乳酸菌，它不僅可以幫助調(diào)節(jié)人體腸道微生物，對于降低膽固醇也有十分重要的意義[6]。因此在眾多的食品生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，尤其以發(fā)酵食品的生產(chǎn)最為突出，如泡菜[7]、米酒[8]、醬油[9]、酸奶[10]、食醋[11]等。鲊廣椒是一種經(jīng)過自然發(fā)酵的調(diào)味品，研究表明鲊廣椒中蘊(yùn)含了豐富的乳酸菌資源[12]。因此，本研究從恩施州咸豐地區(qū)采集自然發(fā)酵的鲊廣椒樣品，使用傳統(tǒng)可培養(yǎng)法，對鲊廣椒中的乳酸菌進(jìn)行了分離、純化與鑒定，并使用所分離到的乳酸菌發(fā)酵制作泡菜，對泡菜水進(jìn)行品質(zhì)評價，以期為發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)提供候選菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆、食鹽：襄陽市襄城區(qū)鑫源超市；泡菜壇子：淄博海沃家具專營店；石蕊牛乳培養(yǎng)液：湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；MRS 培養(yǎng)基 [蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂（均為生物試劑）、乙酸鈉、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、葡萄糖（均為分析純）]、甘油，氯化鈉，磷酸，磷酸二氫鉀：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鲊廣椒樣品：從恩施州咸豐地區(qū)農(nóng)戶家中采集了5 份不同來源的鲊廣椒樣品，裝入無菌樣品瓶，并使用樣品箱迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器

LRH-150 生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LXJ-IIB 型低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SA402B 味覺分析系統(tǒng)（該系統(tǒng)包含AAE、CTO、CAO、COO、AEI 等 5 個測試傳感器，2 個參比傳感器）：日本 Insent 公司；PEN3 電子鼻：德國 Airsense公司；LC202ADXR高效液相色譜儀：日本島津公司；KH-100DY 超聲波清洗機(jī)：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離及純化

從采集到的5 份恩施州咸豐地區(qū)鲊廣椒中進(jìn)行乳酸菌的分離：首先取樣品2 g 加入到15 mL 無菌的石蕊牛乳培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，然后用生理鹽水將石蕊牛乳培養(yǎng)液稀釋至梯度為10-5、10-6和10-7，涂布到含有1%碳酸鈣的MRS 培養(yǎng)基中，置于厭氧工作站中37 ℃培養(yǎng)2 d。根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑選產(chǎn)生透明圈的菌株，進(jìn)行革蘭氏染色與過氧化氫酶試驗(yàn)[13]。將具有透明圈、革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌作為待定的乳酸菌在MRS 平板上進(jìn)行連續(xù)劃線分離純化，將純化后的菌株使用30%的甘油于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

具體方法參照王丹丹等[14]的方法。即將純化后的乳酸菌接入MRS 培養(yǎng)基中收集菌體，進(jìn)行菌株DNA的提取，然后以提取的DNA 為模板應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，將擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物連接載體和克隆進(jìn)行基因組的測序，將測序后獲得的乳酸菌166S rRNA 序列在NCBI 的GenBank中進(jìn)行Blast 比對，選取同源性較高的菌作為模式菌株，構(gòu)建乳酸菌分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定所分立的乳酸菌的系統(tǒng)分類地位。

1.3.3 泡菜的制作方法

泡菜制作的工藝流程：豇豆→清洗→瀝干→裝壇→加入鹽水→接種→發(fā)酵→產(chǎn)品檢測。具體操作為，菌種的準(zhǔn)備：將分離并鑒定的乳酸菌使用MRS 液體培養(yǎng)基連續(xù)活化3 代，并使用生理鹽水重懸。配制鹽水：按照每升水稱取40 g 食鹽的比例溶解、煮沸、冷卻晾涼；選材：豇豆無蟲蛀，硬度好；裝壇：稱取豇豆250 g，切成5 cm 小段，裝入壇中，再加入晾涼的鹽水635.5 mL；接種：按照1%[15]添加量接入所分離的乳酸菌；發(fā)酵：將裝壇并接種了乳酸菌的壇子在25 ℃條件下放置7 d。

1.3.4 泡菜水的電子鼻測定

具體方法參考楊成聰?shù)萚16]的方法，即首先量取15 mL 泡菜水樣品裝于樣品瓶中，55 ℃水浴保溫10 min 后，室溫25 ℃下靜置10 min，然后插入電子鼻探頭進(jìn)行頂空進(jìn)樣測試（注意避免樣品沾到瓶蓋）。電子鼻金屬氧化電極測定時，在45 s 左右達(dá)到穩(wěn)定，為避免測試誤差，本研究選取49、50 s 和51 s 時的平均值作為數(shù)據(jù)分析。檢測條件：清洗時間150 s，探頭插入時間5 s，自動調(diào)零時間5 s，進(jìn)樣流速120 mL/min，內(nèi)部流量120 mL/min。

1.3.5 電子舌的測定

183＊＊＊＊8081：黃昏里，古巷中，老樹下。老人機(jī)，發(fā)短信，求上墻。期中考，心好慌，求小意，上個墻。

樣品的準(zhǔn)備：首先分別量取150 mL 泡菜水樣品，常溫下10 000 g 離心5 min，然后收取上清液，再量取60 mL 上清液用無菌水稀釋至一倍備用。樣品檢測：當(dāng)電子舌系統(tǒng)進(jìn)行傳感器自檢和診斷后，將經(jīng)處理后的樣品倒入樣品測試杯中，然后參照Kobayashi 等[17]的方法進(jìn)行操作，對不同樣品的酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、后味A（澀味的回味）以及后味B（苦味的回味）7 個不同滋味進(jìn)行檢測分析。

1.3.6 泡菜水有機(jī)酸的測定

流動相的配制：配制0.01 mol/L 磷酸二氫鉀的溶液，調(diào)節(jié)pH 值至2.3，進(jìn)行抽濾，然后超聲5 min 后備用。樣品的前處理：吸取2 mL 的泡菜水到10 mL 容量瓶中，加入 200 μL 的 0.1 mol/mL 的磷酸溶液，加流動相至10 mL。將已處理好的樣品溶液過0.22 μm 濾膜，取1 mL 裝入樣品瓶中進(jìn)行測定。測定條件：使用反向C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）進(jìn)行檢測，檢測器波長為 215 nm，流速為 1 mL/min，進(jìn)樣量為 20 μL，柱溫為30 ℃。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS Statistics 17.0 的Kruskal-Wallis 對不同泡菜水樣品進(jìn)行顯著性分析，作圖均使用origin 8.5進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

圖1 部分乳酸菌分離菌株形態(tài)Fig.1 The morphology of the lactic acid bacteria isolates

將得到的20 株乳酸菌提取基因組DNA，并通過PCR 與測序，獲得它們的16S rRNA 序列后，在Gen－Bank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對，比對結(jié)果顯示這些菌株的序列均與植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）及類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）的模式菌的16S rRNA 序列之間的相似度均達(dá)到99%以上。從NCBI 數(shù)據(jù)庫提取相似度較高的模式菌的16S rRNA 基因序列，使用MEGA7.0[18]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，所分離的乳酸菌與植物乳酸桿菌、戊糖乳桿菌與類植物乳桿菌模式菌聚在同一分支上。有研究認(rèn)為可以通過多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）法將植物乳桿菌分成不同的類型[19]，因此本研究通過16S rRNA 基因序列分析尚無法將植物乳桿菌群的乳酸菌鑒定到種，只能將所分離到的20 株乳酸菌鑒定為植物乳桿菌群（Lactobacillus plantarum-group）[20]。

圖2 基于16S rRNA 基因序列的乳酸菌分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolates based on 16S rRNA gene sequence analysis

2.2 發(fā)酵不同泡菜揮發(fā)性風(fēng)味的分析

電子鼻是一個模仿生物嗅覺的系統(tǒng)，能夠?qū)Υ蠖鄶?shù)揮發(fā)性成分的氣體進(jìn)行分析和檢測，主要由三部分組成：氣體流量系統(tǒng)、傳感器組和分析控制軟件。其中傳感器組是由10 個金屬氧化氣體傳感器組成，分別為W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W、W3S。不同的傳感器能夠?qū)Σ煌N類的氣味物質(zhì)做出響應(yīng)，并且不受到主觀因素的影響，因此可以用來對食品的氣味做出客觀的評價。表1為不同種類的傳感器對應(yīng)性能描述。

表1 電子鼻的傳感器性能描述Table 1 Description of sensor performance of electronic nose

使用電子鼻對泡菜水中各風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，把測定的數(shù)據(jù)繪制成箱形圖，見圖3。

圖3 添加不同乳酸菌發(fā)酵的泡菜水風(fēng)味指標(biāo)的箱形圖Fig.3 Box map of various flavor indexes of pickle water fermented with different lactic acid bacteria isolates

由圖3可知，本研究中添加了20 株植物乳桿菌發(fā)酵制作的不同泡菜水樣品間的傳感器W1S 及W1W和W2S 的差異性最大，極差值分別為15.19、12.91 和9.63，即所分離的植物乳桿菌對泡菜水中的甲烷、有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)以及乙醇等風(fēng)味物質(zhì)有較大的作用，且不同的乳酸菌之間，作用差異較大（p＜0.05）。使用傳感器 W1C、W3C、W5C、W3S 與 W6S 對不同泡菜水樣品測定的響應(yīng)值不存在顯著差異，即樣品間的氨氣、芳香味、烷烴與氫氣類氣味物質(zhì)差異不明顯。在泡菜的制作過程中，風(fēng)味物質(zhì)僅僅是影響泡菜品質(zhì)的一個方面。為了進(jìn)一步研究添加植物乳桿菌對泡菜品質(zhì)的影響，本研究將以不同泡菜水樣品測得的滋味指標(biāo)做了進(jìn)一步的分析。

2.3 植物乳桿菌對泡菜水滋味的影響

泡菜的口感是泡菜品質(zhì)的重要體現(xiàn)，一般來說，酸辣可口，同時苦澀味較少的泡菜的品質(zhì)較好。為確定分離到的乳酸菌的泡菜發(fā)酵特性，采用電子舌技術(shù)對泡菜水樣品的滋味指標(biāo)進(jìn)行了評價，結(jié)果見圖4。

圖4 添加不同乳酸菌發(fā)酵的泡菜水各滋味指標(biāo)雷達(dá)圖Fig.4 Radar map of the taste indices of pickles fermented with lactic acid bacteria isolates

由圖4可知，接種了所分離乳酸菌發(fā)酵的泡菜水樣品的咸味、鮮味和豐度與對照組相比，差異不顯著。與未接菌對照處理相比，接種了乳酸菌HBUAS51135、HBUAS51141、HBUAS51146、HBUAS51153、HBUAS -51155、HBUAS51156、HBUAS51157 與 HBUAS51162的泡菜水樣品的苦味與澀味無顯著差異，而后味A 與后味B 均顯著低于對照組（p＜0.05）；同時，接種了乳酸菌HBUAS51135、HBUAS51141、HBUAS51146、HBUAS -51153、HBUAS51155、HBUAS51156 與 HBUAS51157的泡菜水樣品的酸味顯著高于未接菌處理（p＜0.05），具有酸爽的滋味，同時苦味與澀味及它們的回味也較低，因此可以用來進(jìn)一步篩選，用作泡菜發(fā)酵劑開發(fā)的候選菌株。

2.4 泡菜水樣品的有機(jī)酸分析

乳酸菌可以代謝糖類產(chǎn)生乳酸，形成泡菜的酸爽口感，為進(jìn)一步說明泡菜水樣品酸味產(chǎn)生的原因，使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定了泡菜水樣品的有機(jī)酸組成。通過HPLC 系統(tǒng)，檢測到泡菜水樣品中的有機(jī)酸包括6 種，分別是酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，具體結(jié)果見圖5。

圖5 添加不同乳酸菌發(fā)酵的泡菜水中有機(jī)酸含量Fig.5 The organic acids content in pickle water fermented with different lactic acid bacteria isolates

由圖5，與其他有機(jī)酸相比，泡菜水樣品中乳酸最高含量為4.34g/L～10.81g/L，添加了乳酸菌HBUAS51131、HBUAS51134、HBUAS51136、HBUAS51141、HBUA S-51146、HBUAS51149、HBUAS51150、HBUAS51152、HBUAS51155、HBUAS51156、HBUAS51160、HBUAS -51161 和HBUASS51162 的泡菜水中乳酸含量顯著高于對照組，其中添加了乳酸菌HBUAS51131、HBUAS-51134、HBUAS51136、HBUAS51141、HBUAS 51150、HBUAS51155 和HBUAS51156 的泡菜水中乳酸含量高達(dá)9.20 g/L。乳酸主要由乳酸菌產(chǎn)生，酸味更加溫和，表明這幾株菌的產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)，除了能為泡菜的發(fā)酵營造一個酸性環(huán)境，從而抑制一些其他不耐酸的微生物活動，加快發(fā)酵的速度，縮短發(fā)酵周期外[21]，也能賦予泡菜的更加柔和的滋味。相反，乙酸的酸味則較為刺激[22]，從圖5中也可以看出乳酸含量高的泡菜水樣品的乙酸含量較少，因此乳酸含量較高的菌株，更適用于泡菜發(fā)酵劑菌株的開發(fā)。結(jié)合電子舌的滋味測定結(jié)果，乳酸菌HBUAS51141 和HBUAS51156 作為發(fā)酵劑制作的泡菜，苦澀味較輕，同時乳酸含量較高，因此更適于用作泡菜復(fù)合發(fā)酵劑開發(fā)的候選菌株。

3 結(jié)論

從湖北恩施州咸豐地區(qū)采集的5 份鲊廣椒樣品中共分離得到了20 株乳酸菌，均鑒定為植物乳桿菌。使用所分離到的乳酸菌進(jìn)行了豇豆泡菜的發(fā)酵制作，并對豇豆泡菜水品質(zhì)進(jìn)行了品質(zhì)評價，結(jié)果顯示使用乳酸菌HBUAS51141 和HBUAS51156 發(fā)酵的泡菜水中乳酸含量高達(dá)9.20 g/L 以上，同時苦澀味較輕，是豇豆泡菜復(fù)合發(fā)酵劑開發(fā)的優(yōu)良候選菌株。