香蕉低聚糖對雙歧桿菌增殖條件的優(yōu)化

范媛媛，羅詩泳，蘇雪群，王娟

（1.順德出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，廣東 佛山 528303；2.華南理工大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510641）

低聚糖是指由3 個～10 個單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的糖類化合物，是一類重要的生物信息分子，有多方面的生物功能，如增強免疫力、促進益生菌增殖、改善腸道微生態(tài)環(huán)境、抗氧化、增加某些必需礦物質(zhì)元素的吸收等等。在健康人體消化道中的500 多種細菌中，其數(shù)量達100 兆以上，其中雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)正常的菌群，是人類研究最廣泛的益生菌，可以調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉及便秘、排除毒素、提高機體免疫力、抗癌等生理保健功能。雙歧桿菌數(shù)量的減少或消失是“不健康”狀態(tài)的標(biāo)志，雙歧桿菌是人體健康的晴雨表。雙歧桿菌是有益菌，是人類研究最廣泛的益生菌之一。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，低聚糖與益生菌協(xié)同作用，可以更好的發(fā)揮二者的在改善腸道微生態(tài)環(huán)境、預(yù)防和治療腹瀉及便秘等方面的生理功能[1-5]。

目前功能性低聚糖已成為生物技術(shù)方面研究亮點，而國內(nèi)研究主要集中在殼低聚糖、果低聚糖、魔芋低聚糖及一些中藥提取物中的低聚糖，針對香蕉中低聚糖的研究卻相對匱乏，而香蕉低聚糖屬于功能性低聚糖，不僅是雙歧桿菌、乳酸菌等一些益生菌的增殖因子，而且它是替代蔗糖的新型功能性糖源[6-11]。除Wang 等報道了香蕉低聚糖、香蕉抗性淀粉、膳食纖維的潤腸通便功能，并設(shè)計動物實驗證實大蕉低聚糖具有促進腸道蠕動的效果外，有關(guān)香蕉低聚糖對乳桿菌增殖效果的研究卻未見報道[12-18]。

文中以香蕉低聚糖為碳源，以純度大于75%的低聚果糖為陽性對照，探尋香蕉低聚糖是否對雙歧桿菌有增殖作用，以及雙歧桿菌的最佳增殖條件及規(guī)律，為微生態(tài)制劑的研制、微膠囊保健品的開發(fā)、以及集營養(yǎng)、保健、食療于一體的功效食品的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

香蕉低聚糖（低聚糖含量：79.28%）：華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗室自制；青春雙歧桿菌（ATCC 15703）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；低聚果糖（純度＞75%）：廣州菲博生物科技有限公司；基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含葡萄糖）、雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基的配制

試驗組：10 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +（2 g/L～10 g/L）的香蕉低聚糖+1 mL 一定濃度的雙歧桿菌菌懸液。

陰性對照組：10 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0 g/L 的香蕉低聚糖+1 mL 一定濃度的雙歧桿菌菌懸液。

陽性對照組：10 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+4 g/L 的低聚果糖+1 mL 一定濃度的雙歧桿菌菌懸液。

1.2 儀器與設(shè)備

SANYO MIR-153 多功能培養(yǎng)箱：日本三洋公司；ESCO CLASSⅡType A2 生物安全柜：新加坡藝思高科技有限公司；Synbiosis Acolyte 菌落計數(shù)儀：英國Synbiosis 公司；BUGBOX 厭氧工作站：UK SUSKINN TECHNOLOGY LTD。

1.3 方法

1.3.1 香蕉低聚糖的提取、純化及含量測定

用超聲波法輔助提取香蕉低聚糖，粗提液經(jīng)過凝膠柱層析純化后，采用蒽酮-硫酸法測定低聚糖含量[19-21]。

1.3.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制

大豆蛋白胨5.0 g、酵母粉10.0 g、胰胨5.0 g、無機鹽液 40 mL（每 1 L 含 K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、CaCl20.2 g、MgSO4·7H2O 0.48 g、NaHCO310.0 g、NaCl 2.0 g、L-半胱氨酸0.5g）、蒸餾水1L[22]。121℃高壓滅菌30min，pH 值調(diào)至 7.0～8.0。

1.3.3 制備菌懸液

無菌條件下，將標(biāo)準(zhǔn)菌株活化，即將青春雙歧桿菌（ATCC 15703）標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于無菌平皿內(nèi)，及時將15 mL～20 mL 冷卻至46 ℃雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基傾注于平皿，混合均勻后，于36 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，從培養(yǎng)后的平板中挑取適量的菌落，接種于無菌生理鹽水，攪拌均勻后，進行梯度稀釋，再用無菌吸頭吸取1 mL 菌懸液接種于無菌平皿內(nèi)，同上操作后進行培養(yǎng)、計數(shù)[23-25]。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，選取濃度在104CFU/mL～108CFU/mL 的菌懸液備用。

1.3.4 培養(yǎng)時間對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響

將不同質(zhì)量濃度的香蕉低聚糖（2、4、6、8、10 g/L）和1 mL 的5.2×106CFU/mL 的菌懸液，分別加入10 mL的pH 7.5 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；同時做陰性、陽性對照組?；靹?，于（36±1）℃厭氧培養(yǎng) 48 h，雙歧桿菌在 24 h 內(nèi)增殖緩慢，培養(yǎng)期間，選取不同的時間點計數(shù)（12、24、28、32、36、40、44、48 h），每個時間點做 3 個平行，取平均值。

1.3.5 香蕉低聚糖的添加量對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響

在 pH7.5、接種量為 1 mL 的 5.2×106CFU/mL 的雙歧桿菌菌懸液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加濃度為2、4、6、8、10 g/L 的香蕉低聚糖，（36±1）℃厭氧培養(yǎng) 40 h，分別測定雙歧桿菌的菌落數(shù)，取對數(shù)后與添加量作圖，比較不同香蕉低聚糖添加量對雙歧桿菌增殖數(shù)量的差異，得出最佳低聚糖的添加量。

1.3.6 初始菌液濃度對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響

將 1 mL 不同濃度的雙歧桿菌菌懸液（104、105、106、107、108CFU/mL）和 4 g/L 的香蕉低聚糖加入 10 mL的pH 7.5 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)40 h，分別測定不同濃度的菌懸液中雙歧桿菌的菌落數(shù)。每個濃度做3 個平行，取平均值?？芍p歧桿菌菌落數(shù)最高時的初始菌液濃度。

1.3.7 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH 值對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響

將4 g/L 的香蕉低聚糖和1 mL 的5.2×106CFU/mL的菌懸液，分別加入 10 mL 的 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，于（36±1）℃厭氧培養(yǎng)40 h，分別測定不同pH 值的菌懸液中雙歧桿菌的數(shù)量。每個pH 值做3 個平行，取平均值。可知此雙歧桿菌菌落數(shù)最高時的基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH 值。

1.3.8 Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計

按照Box-Behnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，選擇對雙歧桿菌增殖有顯著影響的4 個因素：培養(yǎng)時間（A）、低聚糖添加量（B）、初始菌液濃度對數(shù)值（C）和基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH 值（D），進行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，每個處理測定3 次，取平均值。試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用統(tǒng)計分析軟件Design Expert 建立回歸模型，確定雙歧桿菌最佳增殖數(shù)量的條件及各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，并對雙歧桿菌增殖規(guī)律的數(shù)學(xué)模型進行方差分析，以驗證真實值與預(yù)測值之間及檢驗方程的有效性。建立各因素間的回歸優(yōu)化響應(yīng)曲面圖，并對各因素間的交互作用進行方差分析與優(yōu)化，通過回歸模型得出雙歧桿菌的最佳增殖條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響

以雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)與培養(yǎng)時間作圖見圖1。

圖1 培養(yǎng)時間對青春雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.1 Effect of culture time on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

由圖1可知，不同質(zhì)量濃度的香蕉低聚糖（2、4、6、8、10 g/L），對雙歧桿菌的增殖作用都是在培養(yǎng)40 h 左右達到高峰，然后雙歧桿菌的生長進入穩(wěn)定期。陰性對照組在48 h 的培養(yǎng)期間內(nèi)，菌落數(shù)變化無顯著性差異（P＞0.05），陽性對照組在 36 h 起，雙歧桿菌數(shù)量可達到108數(shù)量級，在40 h 達到高峰。此外，陽性對照組的菌數(shù)大于香蕉低聚糖添加量為4 g/L 的培養(yǎng)液中的菌數(shù)。說明香蕉低聚糖作為碳源對雙歧桿菌的增殖作用沒有低聚果糖強。

2.2 低聚糖添加量對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響

以雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)與低聚糖的添加量作圖見圖2。

由圖2可知，不同濃度的香蕉低聚糖對雙歧桿菌的體外生長有不同程度的影響。當(dāng)?shù)途厶堑奶砑恿繛? g/L 時，雙歧桿菌的增殖數(shù)量最多，可達到108數(shù)量級；當(dāng)?shù)途厶堑奶砑恿繛?0 g/L 時，雙歧桿菌的增殖數(shù)量明顯最低，說明高濃度的低聚糖對雙歧桿菌的生長有抑制作用。這可能是由于高濃度的低聚糖造成培養(yǎng)基的碳源量過高，雙歧桿菌在代謝發(fā)酵后產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基偏酸，造成了高滲透壓的環(huán)境，雙歧桿菌細胞脫水，從而抑制了生長。由此說明，低聚糖作為雙歧桿菌的生長增殖因子有一定的濃度作用范圍，過高或過低都不適宜雙歧桿菌的生長[26-28]。

圖2 香蕉低聚糖的添加量對青春雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.2 Effect of additive amount of banana oligosaccharide on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

2.3 初始菌液濃度對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響

以雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)與初始菌液濃度作圖見圖3。

圖3 初始菌液濃度對青春雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.3 Effect of concentration of bacteria suspensions on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

由圖3可知，不同濃度的初始菌液濃度對雙歧桿菌的體外生長有不同程度的影響。在香蕉低聚糖的濃度為4 g/L、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH 值為7.5 時，初始菌液的濃度為106時，雙歧桿菌的數(shù)量達到108數(shù)量級；當(dāng)初始菌液濃度為105時，雙歧桿菌的數(shù)量基本達到最大值。當(dāng)初始菌液濃度小于105時，適應(yīng)期較長；當(dāng)初始菌液濃度大于106時，雙歧桿菌的增殖速度較慢，基本維持在108數(shù)量級。這可能是由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)和能量有限，菌液濃度過高時，菌體間會產(chǎn)生競爭性抑制，導(dǎo)致菌體數(shù)量的平衡或降低，從而使增殖速度減緩甚至停止。

2.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH值對益生菌增殖數(shù)量的影響

以雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)與初始pH 值作圖見圖4。

由圖4可知，香蕉低聚糖的濃度為4 g/L、菌懸液的濃度為106CFU/mL 時，對雙歧桿菌的增殖效果最好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH 值為7.5。當(dāng)pH 值小于7.0 時，雙歧桿菌的增殖速度慢、數(shù)量少，可能是由于培養(yǎng)基的酸度過高，不利于雙歧桿菌的生長繁殖，所以延滯期長，而雙歧桿菌生長又會產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)，導(dǎo)致增殖數(shù)量一直比較低；當(dāng)pH 值為8 時，培養(yǎng)基呈堿性，不利于其生長繁殖[26-28]。

圖4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH 值對青春雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.4 Effect of pH of basic medium on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.5.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，得二次多項式回歸方程：

Y=-147.098 58+1.390 75A+0.294 41B+2.551 71C+32.412 79D+0.004 062 5AB-0.011 450AC-0.033 978AD+0.012 500BC+2.067 79×10-15BD-0.114 09CD-0.0131 21A2-0.060 395B2-0.103 68C2-2.070 41D2

為了檢驗方程的有效性，對雙歧桿菌增殖規(guī)律的數(shù)學(xué)模型進行方差分析，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and test results

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken design and test results

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

方差分析中模型P 值＜0.0001 說明回歸方程是極顯著的（P＜0.01），相關(guān)系數(shù) R2=0.986 5 說明響應(yīng)值的變化有98.65%來源于所選變量，即培養(yǎng)時間、低聚糖添加量、初始菌液濃度對數(shù)值和基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH 值。失擬項不顯著，說明模型合適，回歸方程對試驗擬合情況好，可以較好的描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析。

一次項中培養(yǎng)時間、低聚糖添加量和基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH 值的P 值均小于0.001，說明這3 個因素對結(jié)果的影響非常顯著，且這3 個因素的平方項的P 值也小于0.001，說明這3 個因素的平方項對結(jié)果的影響也非常顯著。一次項中初始菌液濃度的P 值為0.027 2，小于0.05，說明其對結(jié)果的影響顯著。6 個交互項中只有培養(yǎng)時間和基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH 值交互作用的P 值小于0.05，說明二者交互作用對結(jié)果影響顯著。

2.5.2 響應(yīng)面交互作用的分析與優(yōu)化

各因素的交互作用對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響見圖5～圖10。

圖5 培養(yǎng)時間與低聚糖添加量的交互作用對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.5 Effect of culture time and additive amount of banana oligosaccharide on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

圖6 培養(yǎng)時間與初始菌液濃度的交互作用對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.6 Effect of culture time and concentration of bacteria suspensions on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

圖7 培養(yǎng)時間與培養(yǎng)基的初始pH 值的交互作用對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.7 Effect of culture time and pH of basic medium on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

圖8 低聚糖添加量與初始菌液濃度的交互作用對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.8 Effect of additive amount of banana oligosaccharide and concentration of bacteria suspensions on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

圖9 低聚糖添加量與培養(yǎng)基的初始pH 值的交互作用對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.9 Effect of additive amount of banana oligosaccharide and pH of basic medium on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

響應(yīng)曲面坡度越陡峭，說明響應(yīng)值對于該因素的改變越敏感，而曲面坡度越平滑，說明該因素的改變對響應(yīng)值的影響也就越小[29]。由各因子間的回歸優(yōu)化響應(yīng)曲面圖和方差分析可知，培養(yǎng)時間（A）與低聚糖添加量（B）、培養(yǎng)時間（A）與初始菌液濃度對數(shù)值（C）、低聚糖添加量（B）與初始菌液濃度對數(shù)值（C）、低聚糖添加量（B）與基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH 值（D）、初始菌液濃度對數(shù)值（C）與基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH 值（D）的交互作用對雙歧桿菌的增殖影響不顯著，培養(yǎng)時間（A）與基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH 值（D）的交互作用對雙歧桿菌的增殖影響顯著。

圖10 初始菌液濃度與培養(yǎng)基的初始pH 值的交互作用對雙歧桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.10 Effect of concentration of bacteria suspensions and pH of basic medium on the proliferation of bifidobacterium adolescentis

2.5.3 最佳增殖條件的驗證

通過回歸模型得出的雙歧桿菌最佳體外增殖條件為：培養(yǎng)時間為41.49 h，低聚糖添加量為4.48 g/L，初始菌液濃度的對數(shù)為6.26，即菌液濃度為1.82×106CFU/mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH 7.31。在此條件下模型的預(yù)測值為8.944?？紤]到實際操作，將最佳條件調(diào)整為：培養(yǎng)時間為41 h，低聚糖添加量為4.5 g/L，菌液濃度為1.8×106CFU/mL，pH 7.30。在此條件下，進行3 次重復(fù)試驗，實際測得的雙歧桿菌數(shù)量為8.6×108CFU/mL，取對數(shù)后得8.965，與預(yù)測值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為 0.166%，提示此模型和方法的可行性和有效性較好。

3 結(jié)論

方程與實際操作所確定的雙歧桿菌最佳增殖條件為：培養(yǎng)時間41 h，低聚糖添加量為4.5 g/L，菌液濃度為1.8×106CFU/mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH 值為7.30。在此條件下，進行3 次重復(fù)試驗，實際測得的雙歧桿菌數(shù)量為8.6×108CFU/mL，取對數(shù)后得8.965，與預(yù)測值的RSD 值為0.166%。提示此模型和方法的可行性和有效性較好，本試驗所得模型合適，回歸方程對試驗擬合度好，其最佳優(yōu)化條件適合于雙歧桿菌的增殖。