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    新資源食品提取物輔助降血糖配方的確定

    2019-08-27 09:25:06劉同方于燕波李淑娟沈起兵張國文李亦凡
    關(guān)鍵詞:抑制率提取物葡萄糖

    劉同方, 于燕波, 李淑娟, 沈起兵, 張國文, 李亦凡, 陳 斌

    (深圳市綠航星際太空科技研究院, 廣東 深圳 518117)

    隨著對糖尿病基礎(chǔ)研究的深入,越來越多的治療藥物研制成功并投入臨床使用。西藥降血糖作用明顯、起效快,但往往缺乏整體的協(xié)調(diào)性,具有明顯的副作用,不利于糖尿病患者長期使用[1]。近年來,諸多研究表明中藥對糖尿病具有多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)的綜合治療作用,且中藥治療疾病的毒副作用較小[2-4]。所以,從天然的植物中尋找降血糖的有效成分是開發(fā)治療糖尿病食品的一條重要的途徑。已有研究表明,白子菜[5]、苦瓜[6]、青錢柳[7]、桑葉[8]、甜茶葉[9]、玉竹[10]、葡萄皮[11]、枇杷葉[12]等植物中的活性成分具有降低血糖和促進(jìn)胰島素分泌等作用。本研究主要通過對植物提取物進(jìn)行篩選,并進(jìn)行配方優(yōu)化,最后進(jìn)行體外降血糖功能評價實驗,以期為研制具有輔助降血糖功能的配方提供支持。

    1 實驗部分

    1.1 材料與試劑

    MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(MTT cell proliferation and cytotoxicity assay kit),美國Amrecso公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),美國Sigma公司;4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG),上海晶純生化科技股份有限公司;α-葡萄糖苷酶(酵母源),美國Sigma公司;阿卡波糖片,拜耳醫(yī)藥保健有限公司;MEM低糖培養(yǎng)基及胰蛋白酶(含0.25%乙二胺四乙酸),美國Gibco公司;地特胰島素,丹麥諾和諾德公司;HepG2細(xì)胞株購于北京協(xié)和醫(yī)院;葡萄糖測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、葡萄糖等均為分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;提取物原料為固體粉末狀,由張家界至誠生物有限公司提供。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DK-8B型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏試驗設(shè)備有限公司;UV-2600型紫外-可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司;AL204型電子天平,瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;BCL-1000A型超凈工作臺,北京亞太科隆公司;MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱,美國SANYO儀器有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測定

    取10 mL試管,依次加入pH=6.8磷酸緩沖液1.85 mL,0.40 U/mL酶溶液100 μL,加入100 μL樣品溶液,渦旋振蕩混合均勻,37 ℃恒溫水浴15 min,再加入0.011 6 mol/LpNPG溶液50 μL,渦旋振蕩混合均勻,37 ℃恒溫水浴20 min,再加入8.00 mL 0.20 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng),405 nm處測定吸光度值,α-葡萄苷酶活性抑制率計算見式(1)。

    (1)

    式(1)中,E抑制率為α-葡萄苷酶活性抑制率,A空白為不加樣品反應(yīng)后的吸光度值,A樣品為加入樣品反應(yīng)后的吸光度,A背景為只加樣品的吸光度值,設(shè)阿卡波糖片為陽性對照組,每個樣品做3個平行,取平均值,計算抑制率。

    1.3.2不同提取物原料體外酶抑制率活性比較

    通過對不同濃度桑葉提取物、苦瓜提取物、葡萄皮提取物、甜茶葉提取物、白子菜提取物、玉竹提取物、青錢柳葉提取物和枇杷葉提取物等8種植物提取物原料(見表1)進(jìn)行體外酶抑制率活性比較,篩選出活性較強的普通食品、新食品或藥食同源原料提取物進(jìn)行配方優(yōu)化設(shè)計。

    表1 用于降血糖配方設(shè)計的8種植物提取物

    1.3.3配方優(yōu)化設(shè)計

    通過不同原料活性比較實驗,選取活性高于陽性對照組的提取物原料,采用Design Expert 8.0.6中D-optimal限制成分上下界的方法,對組分用量范圍進(jìn)行人為限制,然后通過對回歸方程及各組分等高線圖和響應(yīng)曲面的分析,確定最優(yōu)配方。

    1.3.4HepG2細(xì)胞體外模型降血糖效果評價

    1.3.4.1 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型建立

    參考文獻(xiàn)[13]方法建立體外細(xì)胞模型,HepG2細(xì)胞1×105個/mL接入細(xì)胞培養(yǎng)板,貼壁生長24 h后,加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖溶液,孵育24 h,再加入終濃度為1×10-7mmol/L的胰島素刺激10 min,即建立高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型。

    1.3.4.2 細(xì)胞存活率的測定

    采用MTT法測定細(xì)胞存活率[14],當(dāng)細(xì)胞生長至可傳代后用胰蛋白酶溶液消化,用MEM低糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL,接入96孔板,每孔180 μL。貼壁生長24 h后向細(xì)胞中加入20 μL待測樣品,同時設(shè)添加20 μL 磷酸鹽緩沖液的細(xì)胞孔作為空白對照組,做6個平行實驗。孵育24 h后添加20 μL 5 mg/mL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,隨后吸盡培養(yǎng)基并添加150 μL DMSO,室溫放置10 min后于570 nm處測定吸光度值。將空白組細(xì)胞存活率設(shè)置為100%,細(xì)胞存活率計算見式(2)。

    (2)

    式(2)中,γ細(xì)胞存活率為細(xì)胞存活率,A實驗組為添加待測樣品處理后測得吸光度值,A空白組為添加磷酸鹽緩沖液處理后測得吸光度值。

    1.3.4.3 葡萄糖利用率的測定

    根據(jù)葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法[15]測定葡萄糖含量,實驗組細(xì)胞同時添加葡萄糖溶液和樣品溶液,模型對照組添加葡萄糖溶液和等體積磷酸鹽緩沖液,空白組僅添加等體積無菌磷酸鹽緩沖液,添加葡萄糖終濃度為30 mmol/L,繼續(xù)孵育24 h,添加胰島素(終濃度為1×10-7mmol/L)刺激細(xì)胞10 min,隨后立即吸取上層培養(yǎng)基,用葡萄糖測定試劑盒測定葡萄糖濃度,葡萄糖利用率計算見式(3)。

    (3)

    式(3)中,c1為原培養(yǎng)基中葡萄糖濃度,5.55 mmol/L,c2為葡萄糖添加終濃度,0或30 mmol/L,c3為上層培養(yǎng)基中葡萄糖濃度,mmol/L。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同提取物對α-葡萄苷酶抑制活性比較結(jié)果分析

    不同提取物原料對α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較結(jié)果見圖1。

    圖1 不同提取物原料對α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較Fig.1 Comparison of inhibitory activities of different extracts on α-glucosidase

    由圖1可知,在相同質(zhì)量濃度條件下,桑葉提取物、葡萄皮提取物、青錢柳葉提取物和枇杷葉提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率均大于陽性對照組,因此選取以上4種提取物進(jìn)行配方優(yōu)化設(shè)計。

    2.2 配方優(yōu)化設(shè)計結(jié)果分析

    2.2.1混料設(shè)計方案及結(jié)果

    運用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件,得到實驗方案,并按照實驗方案進(jìn)行實驗,結(jié)果見表2。

    根據(jù)實驗結(jié)果建立回歸方程:

    E抑制率=41.11A+44.25B+42.13C+35.58D-
    26.63AB+17.66AC+33.36AD+17.97BC+
    4.27BD+8.92CD-68.89ABC+176.71ABD-
    63.09ACD+24.21BCD。

    其中A、B、C、D分別表示枇杷葉提取物、青錢柳葉提取物、葡萄皮提取物、桑葉提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù),由回歸方程和方差分析可見,擬合的三次方程中ABD和BCD三次項的系數(shù)為正值,說明枇杷葉提取物、青錢柳提取物、葡萄皮提取物和桑葉提取物對體外抑制率起到貢獻(xiàn)作用,二次項回歸系數(shù)AD項絕對值最大,說明在混料配方中枇杷葉提取物和桑葉提取物復(fù)配液對α-葡萄糖苷酶的體外抑制率的貢獻(xiàn)最大。

    表2 混料設(shè)計方案及結(jié)果

    2.2.2較佳復(fù)配比例的確定與驗證

    當(dāng)葡萄皮提取物添加比例固定在10.00%時,不同比例枇杷葉提取物、青錢柳提取物和桑葉提取物溶液對α-葡萄糖苷酶抑制率影響的等高線圖及3D響應(yīng)面圖見圖2。其中響應(yīng)面圖為曲面,表明因素之間存在交互作用。通過軟件優(yōu)化功能,對最優(yōu)配方進(jìn)行優(yōu)化,并對最優(yōu)配方條件下的結(jié)果進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果見圖3。

    通過數(shù)據(jù)分析,確定較佳復(fù)配比例為:枇杷葉提取物41.82%,青錢柳提取物26.05%,葡萄皮提取物10.00%,桑葉提取物22.13%,體外抑制率的預(yù)測值為 48.73%。按照最優(yōu)的復(fù)配比例進(jìn)行3次重復(fù)驗證實驗,計算結(jié)果,得到配方溶液對α-葡萄糖苷酶的體外抑制率為49.32%±0.15%,與響應(yīng)面的預(yù)測值無明顯差異,說明響應(yīng)面模型優(yōu)化復(fù)配4種提取物的最佳復(fù)配比例的結(jié)果可靠。

    2.3 HepG2細(xì)胞體外模型降血糖效果分析

    2.3.1配方對HepG2細(xì)胞存活率的影響

    圖2 不同比例提取物溶液對α-葡萄糖苷酶抑制率影響Fig.2 Effects of different proportions of extract solutions on inhibitory rate of α-glucosidase

    圖3 數(shù)據(jù)處理軟件對較優(yōu)配方比例的預(yù)測Fig.3 Prediction of proportion of better formular by data processing software

    采用MTT法測定了配方樣品對HepG2細(xì)胞存活率的影響,數(shù)據(jù)采用Duncan’s multiple range test方法分析,不同字母表示顯著性差異,結(jié)果見圖4。結(jié)果表明,配方樣品在質(zhì)量濃度0.125~0.500 mg/mL范圍內(nèi)對細(xì)胞存活率均沒有顯著影響,說明配方樣品在質(zhì)量濃度0.500 mg/mL及以下時對HepG2細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。因此,選定此濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實驗。

    字母代表差異性。圖4 不同濃度配方樣品對HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of different concentrations formula sample on cytoactive of HepG2 cells

    2.3.2配方樣品對高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響

    當(dāng)加入高濃度葡萄糖刺激后,與空白對照組相比模型組的葡萄糖利用率顯著降低,說明成功建立了胰島素抵抗模型。采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定配方樣品對高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響,結(jié)果見圖5。而在添加高濃度葡萄糖刺激的同時,加入不同濃度配方樣品處理,其中實驗組1添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.125 mg/mL樣品溶液,實驗組2添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.250 mg/mL樣品溶液,實驗組3添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.500 mg/mL樣品溶液。結(jié)果表明實驗組顯著提高胰島素抵抗模型的葡萄糖利用率,且促進(jìn)作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應(yīng)。當(dāng)樣品終質(zhì)量濃度為0.500 mg/mL時細(xì)胞對葡萄糖的利用率最高,與模型組相比提高了37.88%。結(jié)果表明配方樣品對高濃度葡萄糖刺激HepG2細(xì)胞造成的胰島素抵抗具有一定的改善作用。

    不同字母代表差異顯著。圖5 配方樣品對高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響Fig.5 Effects of formula samples on glucose utilization in HepG2 cells induced by elevated glucose

    2.3.3配方對高糖和高脂聯(lián)合誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響

    不同字母代表差異顯著。圖6 配方樣品對高糖和高脂聯(lián)合誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響Fig.6 Effects of formula samples on glucose utilization in HepG2 cells induced by elevated glucose and free fatty acids

    測定配方樣品對高糖和高脂聯(lián)合誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響,結(jié)果見圖6。當(dāng)加入高濃度葡萄糖與棕櫚酸刺激后,與空白對照組相比模型組的葡萄糖利用率顯著降低,說明成功建立了胰島素抵抗模型。在添加高濃度葡萄糖和棕櫚酸刺激的同時,加入不同濃度配方樣品處理,其中實驗組1添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.125 mg/mL樣品溶液,實驗組2添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.250 mg/mL樣品溶液,實驗組3添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.500 mg/mL樣品溶液。結(jié)果顯示實驗組顯著提高胰島素抵抗肝細(xì)胞對葡萄糖的利用率。當(dāng)配方樣本終質(zhì)量濃度為0.500 mg/mL時細(xì)胞對葡萄糖的利用率最高,與模型組相比提高了25.63%。結(jié)果表明配方樣品對高濃度葡萄糖與棕櫚酸聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞造成的胰島素抵抗具有一定的改善作用。

    3 結(jié) 論

    本文通過對8種不同植物提取物原料進(jìn)行體外酶抑制率比較,篩選出4種活性較強的提取物原料進(jìn)行配方優(yōu)化設(shè)計,對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出4種提取物具有交互作用,較佳復(fù)配比例為:枇杷葉提取物41.82%,青錢柳提取物26.05%,葡萄皮提取物10.00%,桑葉提取物22.13%。HepG2細(xì)胞體外模型降血糖效果評價實驗結(jié)果顯示配方樣品可提高高糖誘導(dǎo)以及高糖-高脂聯(lián)合誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率,降低細(xì)胞外的葡萄糖濃度,改善胰島素抵抗模型癥狀。

    目前,本配方只進(jìn)行了體外細(xì)胞模型評價降血糖效果實驗,輔助降血糖功能評價實驗有待完善,可望在此配方基礎(chǔ)上,結(jié)合感官評價開發(fā)一款輔助降血糖功能性食品。

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