抗獨(dú)特型抗體在食用農(nóng)產(chǎn)品危害物監(jiān)控中的應(yīng)用研究

徐重新， 張 霄， 劉 媛， 胡曉丹， 朱 慶， 仲建鋒，盧麗娜， 林曼曼， 高美靜， 謝雅晶， 劉賢金

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所/省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210014)

食用農(nóng)產(chǎn)品是食品的基本原料和重要組成部分，是公眾日常生活必不可少的食物來源，其質(zhì)量安全直接關(guān)乎老百姓的健康，乃至社會(huì)和諧穩(wěn)定。威脅食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的因素眾多，從產(chǎn)地環(huán)境的重金屬、生物和化學(xué)毒素污染，到生產(chǎn)過程中不可或缺的有毒有害農(nóng)獸藥投入品，再到收儲(chǔ)運(yùn)環(huán)節(jié)中滋生的致病和產(chǎn)毒微生物及其代謝毒素等。這些污染物危害風(fēng)險(xiǎn)幾乎貫穿整個(gè)產(chǎn)供鏈，給食用農(nóng)產(chǎn)品造成嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)也給人類健康帶來重大安全隱患。對(duì)食用農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)供全過程中質(zhì)量安全危害物的治理、防控和監(jiān)測工作，是各級(jí)政府主管部門和科研工作者不可推卸責(zé)任。

基于“免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說”的抗獨(dú)特型抗體(anti-idiotype antibody，AId或Ab2)因具有抗原“內(nèi)影像”效應(yīng)，即具有與抗原相同的抗原決定簇，從而具有可以模擬抗原決定簇分子構(gòu)象乃至類似生物活性的功能，被普遍認(rèn)為是有望用于靶向設(shè)計(jì)抗原功能效應(yīng)物的可行路徑[1-2]?？躬?dú)特型抗體首先興起于生物醫(yī)藥和分子診斷領(lǐng)域，是目前國內(nèi)外免疫原(特別是疑難免疫原)替代功能效應(yīng)物創(chuàng)制的希望，已經(jīng)在多種抗原替代功能效應(yīng)物創(chuàng)制中獲得成功[3-7]。食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害物多數(shù)都具有免疫原或半免疫原性，其中一些種類如黃曲霉毒素、微囊藻毒素、嘔吐毒素等劇毒物質(zhì)[8]，在制備其檢測用抗體時(shí)，不僅危害科研工作者和免疫動(dòng)物的生命安全，更會(huì)造成生態(tài)環(huán)境的二次污染?？躬?dú)特型抗體為這些危害物的無毒化抗原替代功能效應(yīng)物靶向創(chuàng)制提供了新思路，同時(shí)也為研發(fā)和拓展更為安全的可替代有毒、有害、有爭議的農(nóng)業(yè)投入品(如農(nóng)藥、獸藥、轉(zhuǎn)基因等)生物活性效應(yīng)物指明了方向。

近年來，國內(nèi)外已經(jīng)開始有抗獨(dú)特型抗體在食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害物監(jiān)控上應(yīng)用研究的報(bào)道。本文通過系統(tǒng)梳理食用農(nóng)產(chǎn)品主要危害物種類，全面整理了抗獨(dú)特型抗體在這些危害物監(jiān)控應(yīng)用上的研究狀況，并結(jié)合作者及所在團(tuán)隊(duì)近年相關(guān)研究成果，對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行展望，探討存在的問題并提出擬解決的對(duì)策；旨在為研發(fā)和拓展新型安全的食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害物生物監(jiān)測和生物防控材料提供有價(jià)值的文獻(xiàn)參考。

1 食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全主要危害物及其風(fēng)險(xiǎn)

食用農(nóng)產(chǎn)品在產(chǎn)供過程中，威脅其質(zhì)量安全的危害物種類眾多、來源廣、因素復(fù)雜、危害巨大，歸納起來，可以分為生物源危害物(包括食源性病毒、食源性致病微生物以及產(chǎn)毒真菌、農(nóng)作物、水生生物和動(dòng)物等)和化學(xué)危害物(包括農(nóng)藥、獸藥以及重金屬和類金屬等)兩大類。食用農(nóng)產(chǎn)品中主要危害物種類及其風(fēng)險(xiǎn)，見表1。

表1 食用農(nóng)產(chǎn)品中主要危害物及其風(fēng)險(xiǎn)

續(xù)表1

2 抗獨(dú)特型抗體及其創(chuàng)制技術(shù)原理

抗體是動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的一類特異結(jié)合抗原的大分子蛋白質(zhì)，根據(jù)血清型分析可以將其分為同種型(isotype)、同種異型(allotype)和獨(dú)特型(idiotype, Id或Ab1)三類；其中獨(dú)特型類型是存在抗體分子表位上的獨(dú)特型抗原決定簇的統(tǒng)稱，具有特異型抗原識(shí)別結(jié)合的特性，可以出現(xiàn)在抗體分子的互補(bǔ)決定區(qū)、骨架區(qū)甚至是Fc片段區(qū)域[1]。1974年，Jerne首次提出“免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說”[9]，認(rèn)為動(dòng)物機(jī)體受到免疫刺激后，免疫系統(tǒng)會(huì)發(fā)生一系列的應(yīng)激級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)，由抗原刺激產(chǎn)生抗體，抗體刺激又會(huì)產(chǎn)生抗抗體，如此推進(jìn)，最后調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫機(jī)能達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。由此推斷并經(jīng)證實(shí)，獨(dú)特型抗體會(huì)刺激產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體，按其與獨(dú)特型抗體結(jié)合的特點(diǎn)和功能可分為4類[1]：將骨架區(qū)的獨(dú)特位誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體稱為Ab2α，互補(bǔ)決定區(qū)的獨(dú)特位誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體稱為Ab2β，由靠近和位于互補(bǔ)決定區(qū)的獨(dú)特位誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體稱為Ab2γ，以及由遠(yuǎn)離和位于互補(bǔ)決定區(qū)的獨(dú)特型抗體誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體稱為Ab2ε?？乖庖弋a(chǎn)生獨(dú)特型抗體及進(jìn)一步誘導(dǎo)抗獨(dú)特型抗體產(chǎn)生過程，見圖1(參考文獻(xiàn)[10]，并有細(xì)節(jié)優(yōu)化)。圖1中，Ab2β抗獨(dú)特型抗體因直接由獨(dú)特型抗體互補(bǔ)決定區(qū)(即抗原結(jié)合區(qū)域)誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有抗原“內(nèi)影像”效應(yīng)，在三維結(jié)構(gòu)上與初始抗原類似，由此可以被用于原抗原構(gòu)象乃至生物活性的功能替代效應(yīng)物創(chuàng)制[11-12]。目前，采用抗原多克隆抗體、單克隆抗體以及它們的Fab或F(ab)2片段作為免疫原(用于免疫動(dòng)物)或包被抗原(用于人工抗體庫淘篩)，是生物醫(yī)藥、分子診斷以及免疫檢測領(lǐng)域創(chuàng)制具有抗原功能效應(yīng)物的抗獨(dú)特型抗體的主流方式，涉及的抗獨(dú)特型抗體類型包括多克隆抗體、單克隆抗體和新型人工抗體(如單鏈抗體、納米抗體)等形式[1, 13-15]。

圖1 抗原免疫產(chǎn)生獨(dú)特型抗體及進(jìn)一步誘導(dǎo)抗獨(dú)特型抗體產(chǎn)生過程Fig.1 Schematic diagram of antigen immunization to produce idiotypic antibodies and further induction of anti-idiotypic antibodies production

3 抗獨(dú)特型抗體創(chuàng)制技術(shù)在食用農(nóng)產(chǎn)品危害物監(jiān)控中的應(yīng)用研究狀況

抗獨(dú)特型抗體作為一種可模擬抗原構(gòu)象乃至生物活性的特殊抗體，在食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害物檢測用抗體材料和安全的生物活性效應(yīng)物創(chuàng)制上早有探索研究的報(bào)道。近20年來，國內(nèi)外公開可查的相關(guān)文獻(xiàn)資料見表2。目前抗獨(dú)特型抗體及其創(chuàng)制技術(shù)已經(jīng)在食用農(nóng)產(chǎn)品生物毒素危害物替代檢測、生物農(nóng)藥活性替代效應(yīng)物和致病微生物可替代免疫原等創(chuàng)制上有相應(yīng)報(bào)道，且最主要集中在高危高毒生物毒素的無毒化構(gòu)象模擬用于替代免疫檢測的研究；就抗獨(dú)特型抗體形式而言，已經(jīng)涵蓋了多克隆抗體、單克隆抗體以及新型人工抗體中的單鏈抗體、單域納米抗體以及7肽和12肽抗體等；早期以單克隆抗體類型為主，最近幾年人工抗體類型逐漸成為新的熱點(diǎn)。早在1998年，Tsutsumi等[16]以微囊藻毒素單克隆抗體為免疫原，通過免疫小鼠成功制備了其抗獨(dú)特型單克隆抗體，并建立了酶連免疫檢測方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，測得中抑制質(zhì)量濃度(half-maximum inhibition, IC50)為0.45 ng/mL；Maragos等[17]以嘔吐毒素單克隆抗體Fab片段為免疫原，制備了嘔吐毒素抗獨(dú)特型多克隆抗體血清，初步測得其IC50為0.1 μg/mL；此外，He等[18]、Wang等[19]、Shu等[20]和Qiu等[21]借助噬菌體人工抗體庫及其抗原特異性高通量篩選技術(shù)，分別篩選到了赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、伏馬毒素和Bt Cry1Ab毒素的抗獨(dú)特型人工抗體，并用于毒素檢測。作者所在的科研團(tuán)隊(duì)，近年集成抗獨(dú)特型抗體創(chuàng)制技術(shù)、噬菌體人工抗體庫構(gòu)建和高通量淘篩、鑒定技術(shù)以及抗體親和成熟技術(shù)，并依托單克隆高通量自動(dòng)挑選和生物分子互作高通量分析系統(tǒng)，以Bt Cry殺蟲蛋白抗體為包被靶點(diǎn)，從人源化噬菌體單鏈抗體庫中靶向篩選到了系列具有模擬Bt Cry殺蟲功能的抗獨(dú)特型人源殺蟲蛋白，經(jīng)靶標(biāo)害蟲生測實(shí)驗(yàn)證實(shí)，系列材料對(duì)小菜蛾和稻縱卷葉螟具有良好殺蟲活性，相關(guān)成果已獲國家專利和PCT國際專利授權(quán)[22-25]。

表2 抗獨(dú)特型抗體在食用農(nóng)產(chǎn)品危害物監(jiān)控中的研究報(bào)道

LOD：檢出限。

4 結(jié) 語

抗獨(dú)特型抗體目前在生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究較多、對(duì)象較廣，實(shí)際應(yīng)用也相對(duì)較為成熟，部分產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，其中具有模擬肺癌腫瘤抗原NeuGcGM3的抗獨(dú)特型抗體藥物Racotumomab(商品名為Vaxira)已投入市場[35]。在食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害物監(jiān)控上，目前還僅限于高毒高危生物毒素、致病微生物以及個(gè)別生物農(nóng)藥的無毒化可替代免疫原供檢測或生物活性效應(yīng)物的靶向創(chuàng)制，且均處于初步探索階段，尚無商品化產(chǎn)品。整體而言，無論是在生物醫(yī)藥、分子診斷還是農(nóng)產(chǎn)品、食品質(zhì)量安全危害物檢測及控制等領(lǐng)域，抗獨(dú)特型抗體技術(shù)仍處于萌芽起步階段，受關(guān)注度相對(duì)偏少，可替代抗原功效的產(chǎn)品微乎其微。究其原因，主要受到兩方面問題制約。

1)技術(shù)流程復(fù)雜。創(chuàng)制抗獨(dú)特型抗體的前提是必須先制備針對(duì)抗原決定簇的獨(dú)特型抗體，然后再經(jīng)獨(dú)特型抗體才有可能靶向獲得抗獨(dú)特型抗體，即要經(jīng)歷兩次免疫或庫篩選，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)失誤都會(huì)干擾后續(xù)結(jié)果，只有各個(gè)步驟恰到好處，才有可能獲得具有模擬功效的抗獨(dú)特型抗體。針對(duì)該問題建議：在“免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說”理論無法突破的前提下，探索以人工抗體庫替代傳統(tǒng)動(dòng)物免疫，并組合人工抗體高通量篩選和鑒定系統(tǒng)。這是提高篩選效率較為可行的辦法，現(xiàn)已有初步成功應(yīng)用的實(shí)例，見表2。

2)模擬功效難盡人意?？躬?dú)特型抗體是免疫應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)隨機(jī)產(chǎn)生的一種特殊抗體，無論是采用動(dòng)物免疫還是人工抗體庫淘篩方式，均無法避免抗體分子上非抗原決定簇的巨大干擾。要想恰到好處地獲得針對(duì)獨(dú)特型抗體互補(bǔ)決定區(qū)，且能完整模擬抗原構(gòu)象的Ab2β，其難度系數(shù)不亞于大海撈針，更不要說可替代抗原生物活性的效應(yīng)物。針對(duì)該問題建議：從獨(dú)特型抗體角度，盡量剔除非抗原決定簇，減少干擾；從制備效率角度，可以探索集成串聯(lián)動(dòng)物體內(nèi)富集(免疫)、人工抗體庫體外富集(構(gòu)建抗獨(dú)特型抗體免疫庫)，最后借助蛋白質(zhì)互作同源建模和熱點(diǎn)預(yù)測分析等生物信息學(xué)手段對(duì)捕獲模擬物進(jìn)行親和成熟(如點(diǎn)突變、鏈置換等)[36-38]。

總的來說，抗獨(dú)特型抗體作為具有模擬免疫原構(gòu)象乃至生物活性功能的特殊抗體材料，在食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害物管控上具有很大挖掘潛力，特別是在生物防控方面(如拓展安全的、環(huán)境友好的新型農(nóng)獸藥以及防腐保鮮劑等多肽材料)具有重要科學(xué)意義。