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    外源性cAMP對糙皮側(cè)耳原基形成的影響

    2019-08-27 06:34:50張夢珂戚元成邱立友申進文
    食用菌 2019年4期
    關(guān)鍵詞:側(cè)耳原基培養(yǎng)箱

    張夢珂 戚元成 文 晴 邱立友 申進文

    (河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,河南鄭州450002)

    糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus),又稱平菇,廣泛分布于世界各地,其肉質(zhì)肥厚、味道鮮美,具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。平菇經(jīng)擔孢子萌發(fā)形成單核菌絲,單核菌絲接合而成雙核菌絲,當環(huán)境條件適宜時,雙核菌絲扭結(jié)形成原基進而發(fā)育成熟形成子實體[2-3]。糙皮側(cè)耳雙核菌絲誘發(fā)形成原基進而發(fā)育成熟為子實體受到各種環(huán)境因素的影響,如光、溫度、濕度、二氧化碳[4]和培養(yǎng)料碳氮比,這些條件共同作用誘導菌絲體形成原基發(fā)育成子實體,但原基誘發(fā)和子實體的發(fā)育機制還沒有得到完全解析。

    環(huán)磷酸腺苷(cAMP)作為信號轉(zhuǎn)導途徑中的“第二信使”[5],在原核及真核細胞中均有發(fā)現(xiàn),響應(yīng)多種胞外刺激,調(diào)節(jié)生物生長發(fā)育[6]。在生物體內(nèi),cAMP誘導的真核基因表達與蛋白激酶A(PKA)的激活緊密相關(guān),一方面cAMP水平的升高可以激活PKA,另一方面PKA又可以磷酸化某些特定的轉(zhuǎn)錄因子,促進cAMP誘導的基因表達[7]。敲除裂褶菌蛋白激酶A(PKA)和腺苷酸環(huán)化酶編碼基因,能引起突變株的子實體產(chǎn)量降低或子實體發(fā)育異常。cAMP信號涉及真菌的很多細胞過程,如細胞生長、新陳代謝、形態(tài)發(fā)生、脅迫響應(yīng)和病原真菌的侵染能力等[8]。在擔子菌中,cAMP可以誘導灰蓋鬼傘的單核體菌株產(chǎn)生子實體,阻止cAMP的合成延緩雙核菌絲體扭結(jié)形成原基,以高濃度的葡萄糖抑制cAMP的累積從而抑制原基的產(chǎn)生[9]。研究通過分析外源性cAMP對糙皮側(cè)耳菌絲生長及原基形成的影響,旨在為進一步從分子水平解析糙皮側(cè)耳原基形成過程中cAMP的作用機制提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    糙皮側(cè)耳新831,由河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院應(yīng)用真菌實驗室保藏。

    蔗糖天冬酰胺合成培養(yǎng)基(SA,固體培養(yǎng)基):蔗糖 20 g,天冬酰胺 0.88 g,磷酸二氫銨 2.0 g,L-纈氨酸1.0 g,三水磷酸氫二鉀0.224 g,磷酸二氫鉀0.803 g,七水硫酸鎂0.99 g,氯化鈣0.02 g,微量元素溶液5 mL,維生素核苷酸溶液5 mL,瓊脂粉20 g,蒸餾水1000 mL。微量元素溶液:七水硫酸鋅0.89 g,硫酸錳0.765 g,檸檬酸鐵0.73 g,五水硫酸銅0.20 g,蒸餾水1000 mL。維生素核苷酸溶液:腺苷1.60 g,維生素B10.02 g,蒸餾水1000 mL。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 不同濃度的cAMP對糙皮側(cè)耳菌絲生長及原基形成的影響

    將外源添加藥品按添加濃度現(xiàn)用現(xiàn)配,過濾除菌后備用,添加濃度 0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L,SA培養(yǎng)基融化冷卻到約60℃時,加入相應(yīng)濃度cAMP混勻后制平板。將活化后的新831菌絲,用打孔器打取直徑5 mm的邊緣菌絲塊,菌絲正面朝上接入制備好的固體平板培養(yǎng)基中央,在25℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。待某個處理的菌絲滿板時,測定糙皮側(cè)耳菌絲生長速度,隨后10℃恒溫培養(yǎng)箱光照黑暗交替(8 h光照、16 h黑暗)培養(yǎng)18 d,記錄原基形成情況(拍照),并測定相應(yīng)蛋白濃度。每個濃度10個板,三次重復。

    1.2.2 菌絲平均長速的測定

    參照1.2.1生物接種方法接種,25℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng),待某個處理的菌絲滿板時即結(jié)束培養(yǎng)。通過十字交叉法測定菌絲生長長度(mm),并計算出菌絲平均生長速度。

    菌絲平均生長速度(mm/d)=菌絲生長長度(mm)/培養(yǎng)天數(shù)(d)

    1.2.3 蛋白濃度的測定

    蛋白含量測定原理:蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸可與考馬斯亮藍G250染料結(jié)合,使考馬斯亮藍G250染色液由黑棕色變?yōu)樗{色,并且生成的藍色產(chǎn)物在595 nm處有最大吸收峰值。因此,通過測定反應(yīng)液的OD595值,并帶入蛋白濃度標準曲線即可計算出溶液中的蛋白濃度。

    (1)蛋白濃度標準曲線的制作方法:根據(jù)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)的操作說明測定不同蛋白濃度下的OD595值,如表1所示。

    表1 蛋白濃度標準曲線繪制

    (2)蛋白濃度測定方法:取5 μL待測液至酶標管內(nèi),之后加入200 μL考馬斯亮藍G250染色液,室溫放置10 min,測定OD595值。將OD595值代入蛋白標準曲線所示標準曲線公式中,計算出待測液中的蛋白濃度。

    1.2.4 cAMP對糙皮側(cè)耳PKAC-1和PKAC-2基因表達量的影響

    根據(jù)上述試驗結(jié)果,選取cAMP1mmol/L的添加濃度制備平板,同時把cAMP 0mmol/L作為空白對照,將糙皮側(cè)耳新831接種于平板中央。培養(yǎng)條件:25℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng),待菌絲滿板,隨后10℃恒溫培養(yǎng)箱光照黑暗交替(8 h光照、16 h黑暗)培養(yǎng)4 d、8 d、12 d、16 d、20 d,每個培養(yǎng)時間3個板,三次重復。Trizol法提取不同時間總RNA,取1 μg總RNA樣品,參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明合成cDNA的第一條鏈,選取糙皮側(cè)耳actin為內(nèi)參基因,參照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明,實時熒光定量分析在不同培養(yǎng)時間添加cAMP與空白對照組糙皮側(cè)耳PKAC-1和PKAC-2的差異表達。qRT-PCR反應(yīng)體系為:10 μL SYBR Green Master Mix,上下游引物各0.8 μL(10 μmol/L),1 μLcDNA,7.4 μL ddH2O。循環(huán)參數(shù)設(shè)定為:95℃預變性3 min;95℃30 s,60℃25 s,共40個循環(huán),3次重復。反應(yīng)在applied 7500實時熒光定量PCR儀上進行,利用2-ΔΔCT的方法計算目的基因相對表達量。試驗所需引物如下:PKAC-1熒光定量-F TCTGTCGATCCCCAAATGCC,PKAC-1熒光定量-R GCGTACCCTTGACCTCGAAA,PKAC-2熒光定量-FATTGTTCACGCTGCTACGGA,PKAC-2熒光定量-RTCAGGCTTGAGGTCCCGATA。

    試驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析(LSD,P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳(新831)菌絲長速的影響

    不同cAMP濃度對糙皮側(cè)耳菌絲平均長速的影響見圖1。在測試濃度范圍內(nèi),隨著cAMP濃度的增加,糙皮側(cè)耳菌絲平均長速先快后慢,cAMP添加濃度為1 mmol/L時菌絲平均長速達到最大值,cAMP添加濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L能顯著提高糙皮側(cè)耳菌絲平均生長速度(P<0.05),添加cAMP濃度繼續(xù)升高,對菌絲生長出現(xiàn)抑制作用,但抑制效果不顯著。

    圖1 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳(新831)菌絲長速的影響

    2.2 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳(新831)原基形成的影響

    不同cAMP濃度對糙皮側(cè)耳(新831)菌絲原基形成的影響見圖2。10℃恒溫培養(yǎng)箱光照黑暗交替(8 h光照、16 h黑暗)培養(yǎng)18 d后,未添加cAMP的空白對照組,未見原基形成;cAMP添加濃度為1 mmol/L時明顯可見原基形成;添加濃度為2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L時,平板中可見菌絲扭結(jié),且隨著添加濃度的升高,菌絲扭結(jié)越少;其他cAMP添加濃度與對照組沒有差異。

    圖2 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳(新831)菌絲原基形成的影響

    2.3 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳(新831)菌絲蛋白含量的影響

    將上述1.2.1所得添加不同濃度cAMP培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲,按照蛋白濃度測定方法,測定菌絲蛋白含量。結(jié)果表明,在試驗濃度范圍內(nèi),與空白對照組相比,cAMP顯著降低糙皮側(cè)耳菌絲的蛋白含量(P<0.05);cAMP添加濃度為1 mmol/L時,菌絲蛋白含量最低;cAMP添加濃度為2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L時,菌絲蛋白含量略微提高,但仍顯著低于空白對照組(P<0.05)(圖3)。

    圖3 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳(新831)菌絲蛋白含量的影響

    2.4 外源性cAMP對糙皮側(cè)耳(新831)PKAC-1和PKAC-2表達量的影響

    由圖4可見,與對照組相比PKAC-1相對表達量整體下調(diào),其中培養(yǎng)4 d后PKAC-1相對表達量下調(diào)顯著(P<0.05),其他與對照組之間不存在顯著性差異;培養(yǎng)時間8 d、12 d、20 d時,加cAMP組與不加cAMP相比PKAC-2的相對表達量整體上調(diào),且在培養(yǎng)12 d時cAMP顯著提高PKAC-2的相對表達量(P<0.05)。

    圖4cAMP對PKAC-1、PKAC-2相對表達量的影響

    3 小結(jié)與討論

    研究結(jié)果表明,cAMP對糙皮側(cè)耳(新831)菌絲生長影響顯著,適宜濃度的外源cAMP顯著促進糙皮側(cè)耳菌絲生長,但高濃度的外源cAMP抑制菌絲生長,cAMP對糙皮側(cè)耳菌絲生長的影響與對其他一些真菌的效應(yīng)相同。2007年,HU等發(fā)現(xiàn)較高濃度的外源cAMP抑制水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani AG-1IA分離物的菌絲生長[10]。OLIVER等2002年發(fā)現(xiàn)高濃度的外源cAMP抑制致病真菌煙曲霉Aspergillus fumigatus的菌絲生長[11]。

    cAMP添加濃度1 mmol/L能顯著縮短光誘導糙皮側(cè)耳(新831)原基形成所需時間。綠色木霉中的光誘導伴隨著細胞內(nèi)cAMP水平的突然短暫升高[12],磷酸二酯酶抑制劑對光誘導的分生孢子形成有促進作用[13]。1998年,NEMCOVIC等發(fā)現(xiàn)cAMP在調(diào)節(jié)木霉菌分生孢子形成過程中起著關(guān)鍵作用[14]。對白色念珠菌的研究發(fā)現(xiàn),刺激腺苷酸環(huán)化酶生成cAMP能誘導其菌絲形態(tài)發(fā)育,腺苷酸環(huán)化酶等位基因極度活躍或外源cAMP的添加能促進白色念珠菌菌絲發(fā)育[15],而腺苷酸環(huán)化酶缺失菌株(cyr1△)在菌絲發(fā)育方面存在缺陷[16],說明cAMP對于白色念珠菌的菌絲發(fā)育必不可少[17]。

    2006年,ALFREDO等對綠色木霉的研究發(fā)現(xiàn),在綠色木霉的分生孢子形成過程伴隨著PKA活性的升高[18]。實時熒光定量PCR分析cAMP添加后糙皮側(cè)耳(新831)PKAC-1和PKAC-2基因在不同培養(yǎng)時間的差異表達結(jié)果表明,添加cAMP對糙皮側(cè)耳PKAC-1和PKAC-2基因的表達量有一定影響,處理組與對照組相比,PKAC-1表達量差異不顯著,但PKAC-2表達量在培養(yǎng)12 d時顯著上調(diào),表明cAMP可能通過上調(diào)PKAC-2基因的表達量來提高蛋白激酶活性,從而加速原基形成。

    添加外源cAMP對糙皮側(cè)耳原基的形成可能起到了一定作用,研究結(jié)果對探究糙皮側(cè)耳原基形成的分子機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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