毛木耳多糖復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化提取工藝研究

孫 海 黃 榮

（成都正仁宇澤生物科技有限公司，四川成都610081）

毛木耳（Auricularia polytricha）又稱黃背木耳、粗木耳等，屬于擔(dān)子菌綱，木耳目，木耳科，木耳屬中的毛木耳種[1]。野生毛木耳主要分布在四川、云南、福建等低海拔溫暖濕潤(rùn)山區(qū)。其規(guī)?；^(qū)域性栽培地主要集中在四川省什邡市和福建省部分區(qū)域。毛木耳子實(shí)體膠質(zhì)滑韌，子實(shí)體背面富有絨毛，營(yíng)養(yǎng)豐富，含木耳多糖、麥角甾醇、氨基酸、脂質(zhì)體、纖維素、胡蘿卜素、維生素A、B1、B2及各種無機(jī)元素鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅、鋅、錳、磷等營(yíng)養(yǎng)成分，素有“黑色保健食品”和“樹上海蜇皮”之美稱，有補(bǔ)氣血、降血液黏度、降血脂、清肺潤(rùn)燥、清滌胃腸、通便降壓、化結(jié)石、抗血栓、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)和心肌梗死等功效[2-3]。毛木耳的多種藥效與其含有豐富的多糖密切相關(guān)。毛木耳多糖屬于酸性雜多糖，是由五種單糖和葡萄糖醛酸組成[4]。木耳多糖具有止血、抗凝血和降血脂、抗衰老、改善心臟功能、免疫及抗腫瘤功能、對(duì)機(jī)體細(xì)胞有保護(hù)等多種作用[5]。

毛木耳多糖提取是多糖廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)，因此獲得高效的毛木耳多糖提取技術(shù)尤為重要。目前國(guó)內(nèi)還沒有統(tǒng)一的毛木耳多糖產(chǎn)業(yè)化提取工藝，已有浸提方法提取毛木耳多糖工藝耗時(shí)、耗能、低效，而且對(duì)環(huán)境的影響較大，工業(yè)化生產(chǎn)難度較高。研究利用復(fù)合酶酶解、酵母恒溫恒壓發(fā)酵來提取四川省什邡產(chǎn)野生毛木耳中多糖，并確定最佳產(chǎn)業(yè)化制備工藝條件。該方法利用復(fù)合酶酶解毛木耳的不溶性纖維、膠質(zhì)和植物蛋白成分，并通過酵母發(fā)酵使毛木耳組織蓬松（酵母與糖分解產(chǎn)生二氧化碳和乙醇，加大罐內(nèi)壓力，增強(qiáng)組織滲透壓力）和細(xì)胞壁膨脹破裂有利于充分提取毛木耳中的多糖成分[6]，使工藝更具有產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)降低能耗并改善環(huán)境污染。為優(yōu)化毛木耳多糖的提取工藝提供參考，同時(shí)為毛木耳多糖的綜合開發(fā)和深加工奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料與試劑：毛木耳（四川什邡市澗氐鎮(zhèn)木耳種植協(xié)會(huì)提供）；纖維素酶（2萬U/克）、中性蛋白酶（3萬U/克）、果膠酶（3萬U/克），南寧龐博生物工程有限公司；安琪低糖型酵母，安琪酵母股份有限公司；無水葡萄糖，成都科倫醫(yī)藥有限公司；其他藥品均為市售分析純。

設(shè)備儀器：恒溫恒濕發(fā)酵罐5 L，江蘇科海生物工程設(shè)備有限公司；錐型過濾桶5 L，溫州伯泰機(jī)械科技有限公司；濃縮罐10 L，溫州伯泰機(jī)械科技有限公司；BLK-FD-100真空減壓干燥箱，江蘇昌實(shí)干燥科技有限公司；KH30RF離心機(jī)，湖南凱達(dá)；754N紫外-可見分光度計(jì)，山東晨托科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；電子天平，杭州友恒稱量?jī)x器有限公司；粉碎機(jī)，溫嶺奧力中藥機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原材料預(yù)處理

野生黃背毛木耳洗凈后晾干，剔除發(fā)霉、變質(zhì)等不合格木耳及雜質(zhì)，將干木耳粉碎，過10目篩，制成干木耳粉，置于干燥陰涼處備用。

1.2.2 毛木耳多糖提取率的計(jì)算

毛木耳多糖含量的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[6-7]，采用苯酚—硫酸法測(cè)定毛木耳多糖含量。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=14.86C-0.024，相關(guān)系數(shù)r2=0.9979，線性范圍在0～100 μg/mL，如圖1所示，并計(jì)算毛木耳多糖提取率。

多糖含量（%）=（C×D×F）/W×100

上式中：C為試液中的葡萄糖濃度（mg/L），D為多糖的稀釋因素，F(xiàn)為換算因子，W為毛木耳質(zhì)量。

1.2.3 毛木耳多糖兩種提取方法比較

在實(shí)驗(yàn)室少量樣品試驗(yàn)基層上，進(jìn)行5 kg料和50 kg料擴(kuò)大試驗(yàn)。

1.2.3.1 回流提取法

取毛木耳樣品1.0 g，配制成一定液料比的溶液，經(jīng)過回流浸提，將提取液離心取上清液、濃縮、后加入4倍95%濃度乙醇靜置沉淀多糖、冷凍離心、干燥得到黃背毛木耳多糖。

按上述工藝分別進(jìn)行5 kg和50 kg中試提取試驗(yàn)。

工藝流程：

原料處理→加水混合（加水量通常80%～100%）→加熱回流（70℃）→回收回流液→調(diào)節(jié)pH（6～8）→濃縮1/6→醇析→干燥→粉碎→制得多糖粗品

1.2.3.2 復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵回流提取法

取毛木耳樣品1.0 g，按料液比為1∶35配成溶液，然后加入0.1 g一定量的復(fù)合酶（纖維素酶∶中性蛋白酶∶果膠酶=0.6∶0.4∶0.8）酶活力（2600U），在溫度為80℃，pH為6.0的條件下酶解80 min高溫滅酶后再用安琪低糖型酵母在發(fā)酵壓力0.15～0.2 MPa，溫度為40℃，發(fā)酵20 h，在回流溫度60℃經(jīng)過回流浸提120 min，將提取液離心取上清液、濃縮后加入4倍95%乙醇靜置沉淀多糖、冷凍離心、干燥得到黃背毛木耳多糖。

按上述工藝分別進(jìn)行5 kg和50 kg中試提取試驗(yàn)。

工藝流程：

原料處理→干燥→粉碎（10目）→稱量→酶解→發(fā)酵→回流浸提→過濾→離心取上清液→濃縮至1/4→調(diào)節(jié)pH至6～8→醇析→真空減壓干燥→粗品→粉碎→得毛木耳多糖

1.2.4 復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵法回流提取法（單因素試驗(yàn)）

分別將纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶作為水解用酶，然后用安琪低糖型酵母發(fā)酵，以酶解時(shí)間、酶解溫度、罐內(nèi)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵罐壓力、回流浸提時(shí)間、回流溫度、料液比為可變因素，研究各因素對(duì)多糖得率的影響，得到優(yōu)化的提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種提取方法毛木耳多糖提取率

采用回流提取法（5 kg和50 kg料），其多糖提取率分別為1.42%和1.40%；采用復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵回流法（5 kg和50 kg），其多糖提取率分別為3.60%和3.59%。

采用復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵回流法新工藝，有以下優(yōu)勢(shì)：①粗多糖提取率高于傳統(tǒng)工藝＞150%；②減少用水量，降低環(huán)境污染因素；③減少了乙醇用量，提高了生產(chǎn)效能；④提高了生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效能，更利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵回流提取法單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

由表1可見，在相同發(fā)酵條件、回流浸提時(shí)間溫度、料液比、酶解時(shí)間為80 min條件下，毛木耳多糖提取率隨著酶解溫度上升而上升，但溫度升高到90℃，提取率反而下降。酶解溫度在80℃時(shí)提取率最高，而且回流浸提良好，回流速度均勻。優(yōu)選方案為：酶解溫度為80℃，酶解時(shí)間為80 min。

表1 酶解溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

2.2.2 罐內(nèi)發(fā)酵溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

在人口老齡化加速席卷全球的客觀條件下，不僅我國(guó)面臨著處理職工退休的問題，世界各國(guó)同樣面對(duì)著這個(gè)問題，相對(duì)于我國(guó)進(jìn)入人口老齡化的速度，美國(guó)與日本等國(guó)家首當(dāng)其沖，率先面臨著人口老齡化帶來的危機(jī)。因此，借鑒國(guó)外延遲退休年齡政策在實(shí)踐中的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于我國(guó)制定符合中國(guó)國(guó)情的延遲退休年齡政策，有著不言而喻的重要性。

由表2可見，在酶解溫度為80℃，相同時(shí)間、壓力其他條件不變條件下，隨著罐內(nèi)發(fā)酵溫度上升，毛木耳多糖提取率先高后低，發(fā)酵溫度在40℃時(shí)提取率最高。優(yōu)選方案：發(fā)酵溫度為40℃。

表2 罐內(nèi)發(fā)酵溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

由表3可見，在酶解溫度為80℃，發(fā)酵溫度為40℃，其他條件不變，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，毛木耳多糖提取率先高后低，發(fā)酵時(shí)間在20 h時(shí)提取率最高。優(yōu)選方案：發(fā)酵時(shí)間為20 h。

表3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

2.2.4 發(fā)酵罐壓力對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

由表4可見，在酶解溫度為80℃，發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵時(shí)間20 h，其他條件不變，隨著發(fā)酵罐壓力上升，毛木耳多糖提取率先高后低，發(fā)酵罐壓力維持在0.15 MPa、0.2 MPa時(shí)，毛木耳多糖提取率較高，并且不影響其他工藝。優(yōu)選方案：罐內(nèi)壓力維持在0.15～0.2 MPa。

表4 發(fā)酵罐壓力對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

2.2.5 回流浸提時(shí)間對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

由表5可見，在酶解溫度為80℃，發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵時(shí)間20 h，罐內(nèi)壓力維持在0.15～0.2 MPa，其他條件不變，隨著回流浸提時(shí)間延長(zhǎng)，毛木耳多糖提取率先上升后下降，回流浸提時(shí)間在120 min、150 min時(shí)，提取率較高。優(yōu)選方案：從能耗角度考慮優(yōu)選回流浸提時(shí)間為120 min。

表5 回流浸提時(shí)間對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

由表6可見，在酶解溫度為80℃，發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵時(shí)間20 h，罐內(nèi)壓力維持在0.15～0.2 MPa，回流浸提時(shí)間120 min，其他條件不變，隨著回流浸提溫度上升，毛木耳多糖提取率先高后低，回流浸提溫度60℃時(shí)提取率最高。優(yōu)選方案：回流浸提溫度為60℃。

表6 回流浸提溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

2.2.7 料液比對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

由表7可見，在酶解溫度為80℃，發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵時(shí)間20 h，罐內(nèi)壓力維持在0.15～0.2 MPa，回流浸提時(shí)間120 min，回流浸提溫度為60℃，其他條件不變，在料液比為1∶30～1∶50多糖提取率均高于3%，而且回流液正常。優(yōu)選方案：考慮能耗與環(huán)保因素，取料液比為1∶35。

表7 料液比對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

2.3 優(yōu)選條件下毛木耳多糖提取率

以酶解時(shí)間80 min、酶解溫度80℃、發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間20 h，發(fā)酵壓力0.15～0.2 MPa，回流浸提時(shí)間120 min，回流溫度60℃，料液比為1∶35提取毛木耳多糖，重復(fù)5次。結(jié)果毛木耳多糖提取率分別為3.45%、3.43%、3.42%、3.46%、3.41%，平均值3.43%。

3 小結(jié)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，酶解溫度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、罐內(nèi)壓力、回流浸提時(shí)間、溫度以及料液比對(duì)毛木耳多糖提取率影響較大，優(yōu)選條件下5次毛木耳多糖提取率較為穩(wěn)定，表明該工藝較為成熟。該工藝已經(jīng)進(jìn)入大規(guī)模生產(chǎn)驗(yàn)證階段。