60 Co-γ 射線輻照對黃精中微生物及多糖的影響

黃趙剛， 梁豆豆， 李飛龍， 程 鋼， 葛朝亮

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科， 安徽 合肥230022； 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 安徽 合肥230022）

黃精為百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、 黃精Polygonatum sibiricum Red. 或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua 的干燥根莖, 具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、 健脾、 潤肺、 益腎等功效。 現(xiàn)代藥理研究表明[1-3], 其具有抗衰老、 調(diào)節(jié)免疫、 降血脂、 降血糖、 抗腫瘤、 改善學(xué)習(xí)記憶、 抗骨質(zhì)疏松等作用, 臨床主要用于內(nèi)科疾病, 如痛風(fēng)、高尿酸血癥、 頑固性咳嗽、 糖尿病、 小兒脾疳等, 還可用于男性不育、 婦科疾病, 但其富含多糖類、 氨基酸類成分,故在貯藏過程中易發(fā)生霉變。60Co-γ 射線具有穿透力強(qiáng)、 滅菌效果可靠等特點, 能有效殺蟲防霉, 延長花生、 人參、生姜等藥材的貯藏期[4-6], 但輻照可能導(dǎo)致主要成分含有量變化[7-10]。 因此, 本實驗考察了不同劑量60Co-γ 輻照對黃精滅菌效果及其多糖含有量的影響。

1 材料

1.1 儀器 SCJ-1311 凈化工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；SPX-150B-Z 生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）； 2104 電子天平（十萬分之一, 上海天平儀器廠）；TU-1810 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥 黃精購自亳州市中藥飲片廠 （批號1612023521, 產(chǎn)地云南）, 由合肥杰能輻照科技有限公司分別經(jīng)0.5、 1、 3、 6 kGy60Co-γ 射線輻照處理。 D-無水葡萄糖（110833-201506, 中國食品藥品檢定研究院）； 蒽酮（20170201, 上?？曝S實業(yè)有限公司）； 蛋白胨（20160517-00）、 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（20160111-00）、 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （20171129-00）、 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（20171221-00）、 麥康凱液體培養(yǎng)基（20171208-00）、 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（20180122-00） 均購自杭州微生物試劑有限公司。 所用試劑均為分析純； 水為滅菌注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 滅菌效果評價[11]平皿法測定樣品中需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)、 耐熱菌數(shù), 再以大腸埃希菌為控制菌進(jìn)行控制菌檢查。

2.1.1 供試品溶液制備 取供試品（未輻照及經(jīng)不同劑量輻照的黃精） 25 g, 加入無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（pH=7.0） 225 mL, 40 ～45 ℃下恒溫振搖15 min, 取其清液,即得。

2.1.2 微生物計數(shù) 取供試品溶液及3 個連續(xù)10 倍稀釋級（10-2、 10-3、 10-4）, 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）澆碟法（1 mL/皿） 測定需氧菌總數(shù)； 取供試品溶液及2 個連續(xù)10 倍稀釋級（10-2、 10-3）, 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（含0.1 g/1 000 mL 慶大霉素） 澆碟法（1 mL/皿） 測定霉菌與酵母菌總數(shù)； 取供試品溶液, 沸水浴30 min 后按測定需氧菌總數(shù)的方法檢測耐熱菌數(shù)。

2.1.3 控制菌 （大腸埃希菌） 檢查 取供試品溶液10 mL, 接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中, 30 ～35 ℃下培養(yǎng)24 h, 取1 mL 上述培養(yǎng)物接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中, 42～44 ℃下培養(yǎng)48 h, 劃線接種于麥康凱瓊脂平板上, 30～35 ℃下培養(yǎng)72 h。 如有菌落生長, 則進(jìn)行分離純化及鑒定； 如無菌落生長, 則判斷為未檢出大腸埃希菌（實驗中同時設(shè)置陽性對照）。

2.1.4 微生物檢測 未經(jīng)輻照及經(jīng)不同劑量輻照的黃精在0、 1、 3、 6 個月測定需氧菌總數(shù)、 霉菌與酵母菌總數(shù)（控制菌在0 個月均未檢出, 以后未繼續(xù)檢測； 耐熱菌僅檢測了0 個月）, 結(jié)果見表1。

表1 微生物檢測結(jié)果

2.2 多糖含有量測定[11]

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取105 ℃下干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖對照品33.0 mg, 置于l00 mL 量瓶中, 加水溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即得 （每1 mL 含無水葡萄糖0.33 mg）。

2.2.2 供試品溶液制備 取不同劑量60Co-γ 輻照的黃精適量, 60 ℃下干燥至恒定質(zhì)量, 打成細(xì)粉, 精密稱取約0.25 g （每個樣品平行2 份）, 置于250 mL 圓底燒瓶中,加80%乙醇150 mL, 水浴中加熱回流1 h, 趁熱過濾, 殘渣用80%熱乙醇洗滌3 次, 每次10 mL, 將殘渣及濾紙置于燒瓶中, 加150 mL 水, 沸水浴中加熱回流1 h, 趁熱濾過, 殘渣及燒瓶用熱水洗滌4 次, 每次10 mL, 合并濾液與洗液, 放冷, 轉(zhuǎn)移至250 mL 量瓶中, 加水至刻度, 搖勻, 即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.1、 0.2、0.3、 0.4、 0.5、 0.6 mL, 置于10 mL 具塞刻度試管中, 各加水至2.0 mL, 搖勻, 冰水浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度, 混勻, 放冷后置水浴中保溫10 min, 取出,立即置于冰水浴中冷卻10 min, 取出。 以相應(yīng)試劑為空白,紫外-可見分光光度法在582 nm 波長處測定吸光度。 以吸光度為縱坐標(biāo)（A）, 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸,得方程A = 0.033 7X-0.069 0 （r = 0.999 7）, 在3.3 ～19.8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 樣品含有量測定 取黃精適量, 按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液, 精密量取1 mL, 置于10 mL 具塞刻度試管中, 按“2.2.3” 項下方法測定吸光度, 計算含有量, 結(jié)果見表2。

表2 多糖含有量測定結(jié)果（%， n=2）

3 討論

60Co-γ 射線輻照具有抑制作物發(fā)芽、 保鮮、 殺蟲滅菌等作用, 并且輻照滅菌法具有穿透力強(qiáng)、 滅菌效果好、 成本低廉、 適宜大規(guī)模生產(chǎn)等特點, 已收載于《中國藥典》,但尚無黃精輻照的報道。 根據(jù)《60Co 輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)》 （衛(wèi)藥發(fā)[1997] 第38 號）, 中藥輻照滅菌時允許最大吸收劑量為散劑、 片劑3 kGy, 丸劑5 kGy, 中藥原料粉6 kGy, 結(jié) 合 相 關(guān) 文 獻(xiàn), 本 實 驗 選 擇0.5、 1.0、 3.0、6.0 kGy。

黃精在貯藏過程中容易發(fā)生霉變, 不僅影響外觀, 還可能影響有效成分含有量, 導(dǎo)致療效降低, 甚至出現(xiàn)不良反應(yīng)。 本實驗通過輻照技術(shù)防止黃精霉變, 延長其貯藏期,故選擇需氧菌總數(shù), 霉菌、 酵母菌總數(shù)作為考察指標(biāo), 發(fā)現(xiàn)該藥材經(jīng)沸水浴30 min 后仍檢出耐熱菌, 而1.0 kGy60Co-γ 射線輻照則能有效殺滅。 此外, 還參考文獻(xiàn)[12]選擇大腸埃希菌作為控制菌, 結(jié)果未檢出, 表明未受其污染。

本實驗測定黃精多糖含有量時采用2015 年版《中國藥典》 方法, 故未進(jìn)行方法學(xué)驗證。 文獻(xiàn)[13] 報道, 輻照可引起多糖降解。 是否降解成分溶于80%熱乙醇而被過濾后含有量降低, 具體原因仍不清楚, 對其藥效有何影響也不明確； 唐梅、 曹夏等[14-15]研究表明, 黃精中多糖含有量隨著貯存時間延長而呈下降趨勢, 與本實驗結(jié)果一致, 并且經(jīng)60Co-γ 輻照后亦然。

4 結(jié)論

黃精經(jīng)0.5～6.0 kGy60Co-γ 射線輻照處理后, 在形態(tài)、色澤、 氣味上均無明顯改變； 微生物數(shù)量隨著輻照劑量增加顯著減少, 并且在貯藏過程中微生物增長速度緩慢。 由此可知, 輻照在殺滅霉菌、 耐熱菌等方面效果明顯, 對黃精有明顯防霉作用, 但也可能導(dǎo)致多糖含有量降低, 值得關(guān)注。