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      芪藶強(qiáng)心膠囊中生物堿在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為

      2019-08-26 06:28:22張富賡朱明丹張少強(qiáng)杜武勛肖學(xué)鳳
      中成藥 2019年8期
      關(guān)鍵詞:雙酯甲酰藥動學(xué)

      張 瑜, 張富賡, 朱明丹, 張少強(qiáng), 杜武勛*, 肖學(xué)鳳*

      (1. 天津中醫(yī)藥大學(xué), 天津301617; 2. 天津市環(huán)湖醫(yī)院, 天津300350; 3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 天津300150)

      慢性心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段和主要死因之一, 其發(fā)病涉及多個組織、 器官系統(tǒng)的病理損害, 是21 世紀(jì)心血管領(lǐng)域主要挑戰(zhàn)之一[1]。芪藶強(qiáng)心膠囊首次收載于2015 年版《中國藥典》中, 由黃芪、 附子、 人參、 丹參、 葶藶子等11 味中藥組成, 具有益氣溫陽、 活血通絡(luò)、 利水消腫的功效, 能提高慢性心力衰竭患者運(yùn)動耐性和生活質(zhì)量, 可作為治療慢性心力衰竭的聯(lián)合用藥[2], 附子作為方中君藥, 對患者血流動力學(xué)改變和心室重構(gòu)具有保護(hù)作用[3], 其主要成分二萜類生物堿既是藥效成分, 又是毒性成分[4], 雙酯型生物堿(烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿) 對心臟的毒性作用表現(xiàn)為致心肌細(xì)胞凋亡、 致心律失常和低血壓等[5-7], 但該成分在低濃度時對心肌細(xì)胞也有保護(hù)作用[8], 而水解去掉一個酰基后轉(zhuǎn)化成單酯型生物堿(苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿), 毒性降低, 生物活性減弱[9-10]。因此, 分析芪藶強(qiáng)心膠囊中生物堿的體內(nèi)代謝過程時, 對保證藥物安全性和有效性具有重要意義。

      課題組前期已對芪藶強(qiáng)心膠囊中生物堿進(jìn)行定量研究, 本實驗在此基礎(chǔ)上建立HPLC-MS/MS 法測定血漿中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿血藥濃度, 并研究大鼠灌胃給藥后上述成分的藥動學(xué)行為, 以期為闡釋藥物體內(nèi)過程、篩選藥效物質(zhì)、臨床合理用藥提供實驗依據(jù)。

      1 材料

      1.1 儀器 LC-20A 液相色譜儀, 配置SIL-20AC恒溫自動進(jìn)樣器、 CBM-20A 控制器、 CTO-20A 柱溫箱、 Analyst Software 色譜工作站(1.5.2 版本)、島津LC-20AD 泵(日本島津公司); API4000Qtrap質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司); MIKRO220R型低溫高速離心機(jī)(德國Hettich 公司); Sorvall RC-6Plus 離心機(jī) (美國Thermo Scientific 公司);Targin VX-02 多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司); XS205 電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司]。

      1.2 試藥 芪藶強(qiáng)心膠囊(烏頭堿0.003 mg/g、新烏頭堿0.003 mg/g、 次烏頭堿0.004 mg/g、 苯甲酰烏頭原堿0.023 mg/g、 苯甲酰新烏頭原堿1.072 mg/g、 苯甲酰次烏頭原堿0.896 mg/g) 由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供 (批號140805)。 次 烏 頭 堿 (110798-201308, 含 有 量98.6%)、 新 烏 頭 堿 (110799-201307, 含 有 量98.3%)、 苯甲酰烏頭原堿(111794-201304, 含有量97.5%)、 苯甲酰次烏頭原堿(111796-201304,含有量94.6%)、 苯甲酰新烏頭原堿 (111795-201303, 含 有 量 96.3%)、 丁 螺 環(huán) 酮 (內(nèi) 標(biāo),101059-201101, 含有量99.8%) 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院; 烏頭堿(P23S7F21639,含有量≥98.0%) 對照品購自上海源葉生物科技有限公司。 甲醇為色譜純; 醋酸銨、 甲酸為分析純;水為超純水。

      1.3 動物 健康雄性SD 大鼠, 體質(zhì)量(220±20) g,由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供, 在天津中醫(yī)藥大學(xué)動物房內(nèi)飼養(yǎng), 溫度(22±2)℃, 濕度(50±10)%, 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實驗, 研究經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 色譜條件 Agilent ZOBRAX XDB-C18色譜柱(4.6 mm×50 mm, 3.5 μm); 以水(含5 mmol/L醋酸銨) (A) -甲醇(0.1%甲酸) (B) 為流動相, 梯度洗脫 (0.01 ~1 min, 2% B; 1 ~2 min,2% ~60% B; 2 ~3 min, 60% ~98% B; 3 ~4 min,98%B; 4~4.01 min, 98% ~2%B; 4.01 ~5.5 min,2%B); 體積流量0.45 mL/min; 柱溫40 ℃; 進(jìn)樣量10 μL。

      2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI), 正離子模式下檢測, 掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM); 氣簾氣(CUR) 體積流量20 L/min; 噴霧電壓(IS)5 000 V; 離子源溫度 (TEM) 550 ℃; 霧化氣(GAS1) 體積流量60 L/min; 加熱輔助氣(GAS2)體積流量55 L/min。 質(zhì)譜參數(shù)見表1。

      表1 各生物堿質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters for various alkaloids

      2.3 溶液制備

      2.3.1 對照品溶液 精密稱取烏頭堿、 新烏頭堿、次烏頭堿、 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量, 二甲基亞砜(DMSO) 溶解配制成2.00 mg/mL, 精密量取適量, 甲醇-水(1 ∶1) 稀釋, 即得(分別含烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰次烏頭原堿0.1、 0.2、0.5、 1、 2、 5、 20、 50、 100、 200 ng/mL, 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿0.25、 0.5、 1.25、2.5、 5、 12.5、 50、 125、 250、 500 ng/mL)。

      2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取丁螺環(huán)酮對照品適量,甲醇-乙腈(1 ∶1) 溶解搖勻, 即得(20 ng/mL),置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

      2.4 血漿處理 取血漿50 μL, 加入濃氨水溶液(濃氨水∶水=1 ∶1) 10 μL、 內(nèi)標(biāo)溶液10 μL、 乙酸乙酯500 μL, 渦旋2 min, 15 000 r/min 離心10 min, 取上清液400 μL, 氮?dú)獯蹈? 測定前以100 μL 50%甲醇復(fù)溶, 在“2.1” “2.2” 項條件下進(jìn)樣10 μL 測定。

      2.5 方法學(xué)考察

      2.5.1 專屬性試驗 取空白血漿(等體積甲醇代替內(nèi)標(biāo)溶液)、 空白血漿+對照品(烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰次烏頭原堿質(zhì)量濃度為0.01 ng/mL, 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿質(zhì)量濃度為0.025 ng/mL)、 灌胃給藥(1.3 g/kg)后20 min 大鼠血漿, 按“2.4” 項下方法處理, 在“2.1” “2.2” 項條件下進(jìn)樣測定, 結(jié)果見圖1。 由圖可知, 烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿、丁螺 環(huán) 酮 保 留 時 間 分 別 為3.71、 3.68、 3.73、3.60、 3.53、 3.63、 3.58 min, 生物堿和內(nèi)標(biāo)能完全分離, 不受血漿中雜質(zhì)、 內(nèi)源性物質(zhì)干擾, 方法專屬性良好。

      圖1 各生物堿MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various alkaloids

      2.5.2 線性關(guān)系考察 取大鼠空白血漿50 μL,加入對照品溶液, 得到烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰次烏頭原堿質(zhì)量濃度為0.01、 0.02、0.05、 0.1、 0.2、 0.5、 2、 5、 10、 20 ng/mL, 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿質(zhì)量濃度為0.025、 0.05、 0.125、 0.25、 0.5、 1.25、 5、12.5、 25、 50 ng/mL。 按“2.4” 項下方法處理,在“2.1” “2.2” 項條件下進(jìn)樣測定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X), 對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸, 結(jié)果見表2, 可知各生物堿在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

      表2 各生物堿線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various alkaloids

      2.5.3 精密度、 準(zhǔn)確度試驗 取大鼠空白血漿, 加入低、 中、 高質(zhì)量濃度對照品溶液, 得到含烏頭堿(0.02、 0.5、 16 ng/mL)、 新烏頭堿(0.02、 0.5、16 ng/mL)、 次烏頭堿(0.02、 0.5、 16 ng/mL)、 苯甲酰烏頭原堿(0.05、 1.25、 40 ng/mL)、 苯甲酰新烏頭原堿(0.05、 1.25、 40 ng/mL)、 苯甲酰次烏頭原堿(0.02、 0.5、 16 ng/mL) 的質(zhì)控樣品, 按“2.4” 項下方法處理, 在“2.1” “2.2” 項條件下進(jìn)樣測定, 于同1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)行6 次, 計算日內(nèi)精密度; 連續(xù)進(jìn)行3 d, 計算日間精密度, 結(jié)果見表3, 可知該方法精密度、 準(zhǔn)確度良好。

      表3 各生物堿精密度、 準(zhǔn)確度、 基質(zhì)效應(yīng)、 提取回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of precision, accuracy, matrix effect and extraction recovery tests for various alkaloids (n=6)

      2.5.4 提取回收率、 基質(zhì)效應(yīng) 取“2.5.3” 項下質(zhì)控樣品, 每個質(zhì)量濃度平行6 份, 按“2.4”項下方法處理, 在“2.1” “2.2” 項條件下進(jìn)樣測定, 得到成分峰面積(A); 以甲醇代替空白血漿,其余操作同上, 得到成分峰面積(B); 取大鼠空白血漿, 按“2.4” 項下方法處理后加入質(zhì)控樣品, 在“2.1” “2.2” 項條件下進(jìn)樣測定, 得到成分峰面積(C), 以A、 B 比值計算基質(zhì)效應(yīng), A、C 比值計算提取回收率, 結(jié)果見表3, 可知大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對檢測無影響, 提取回收率符合相關(guān)要求。

      2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.5.3” 項下質(zhì)控樣品,考察凍融穩(wěn)定性(-20 ℃下凍融3 次)、 處理后穩(wěn)定性(自動進(jìn)樣器中放置24 h)、 短期穩(wěn)定性(室溫下放置24 h)、 長期穩(wěn)定性 (-80 ℃下放置30 d), 結(jié)果見表4, 可知穩(wěn)定性良好。

      2.6 藥動學(xué)行為研究 取6 只大鼠, 實驗前禁食12 h, 自由飲水, 灌胃給予1.3 g/kg 藥物混懸液(0.5% CMC-Na 配制), 于給藥后0.083、 0.167、0.333、 0.667、 1、 1.5、 2、 3、 4、 6、 8、 12、24 h經(jīng)目內(nèi)眥靜脈叢取血0.5 mL, 樣品置于肝素鈉抗凝管中, 4 ℃、 12 000 r/min 下離心10 min,分離血漿, 置于-20 ℃冰箱中待測, 血藥濃度-時間曲線見圖2, 再通過DAS 3.0 軟件計算藥動學(xué)參數(shù), 結(jié)果見表5。 由此可知, 灌胃給藥后血漿中附子主要生物堿(烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿)均能檢測到, 其中新烏頭堿最快達(dá)峰, 其次是烏頭堿和次烏頭堿, 再次是苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿, 苯甲酰烏頭原堿最慢; 苯甲酰新烏頭原堿達(dá)峰血藥濃度(Cmax) 和藥時曲線下面積(AUC0~t) 明顯高于其他成分; 烏頭堿、 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿半衰期(t1/2) 較長, 而新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰新烏頭原堿相對較短。

      表4 各生物堿穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of stability tests for various alkaloids (n=6)

      圖2 各生物堿血藥濃度-時間曲線Fig.2 Plasma concentration-time curves for various alkaloids

      表5 各生物堿藥動學(xué)參數(shù)(n=6)Tab.5 Pharmacokinetic parameters for various alkaloids (n=6)

      3 討論

      復(fù)方中藥藥動學(xué)研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的核心,也是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、 活性成分體內(nèi)過程、 藥動-藥效相關(guān)性等研究領(lǐng)域的重要組成部分, 可為臨床合理用藥和安全性評價提供實驗依據(jù)[11-12]。芪藶強(qiáng)心膠囊作為首個經(jīng)循證醫(yī)學(xué)證實的對慢性心力衰竭確有療效的中成藥[13], 其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和安全性探討仍是需要解決的關(guān)鍵問題, 附子作為該制劑君藥占復(fù)方總量的5.929%[14], 其主要藥效成分生物堿也是毒性成分, 故研究大鼠灌胃給藥后雙酯型生物堿(烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿)和單酯型生物堿(苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿) 血藥濃度和藥動學(xué)行為時, 能為芪藶強(qiáng)心膠囊的臨床合理應(yīng)用和安全性監(jiān)控提供依據(jù)。

      前期研究表明[15], 芪藶強(qiáng)心膠囊中單酯型生物堿總平均含有量是雙酯型生物堿的199.1 倍, 本實驗在此基礎(chǔ)上對其體內(nèi)代謝過程進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)后者在大鼠體內(nèi)吸收速度快于前者; AUC 反映藥物進(jìn)入人體循環(huán)的相對量, 是衡量藥物利用程度的重要參數(shù)[16], 本實驗表明苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿的AUC0~∞明顯高于雙酯型生物堿,這可能與其含有量有關(guān)[15], 但單酯型生物堿平均AUC0~∞僅是雙酯型生物堿的1.86 倍, 提示后者在正常機(jī)體內(nèi)的吸收情況優(yōu)于前者。

      4 結(jié)論

      本實驗建立HPLC-MS/MS 法測定大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后雙酯型生物堿(烏頭堿、 新烏頭堿、次烏頭堿)、 單酯型生物堿(苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿) 血藥濃度,經(jīng)方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)該方法符合生物樣品測定要求,可用于生物體內(nèi)藥動學(xué)研究; 雙酯型生物堿在大鼠體內(nèi)吸收速度和吸收程度明顯優(yōu)于單酯型生物堿,可為指導(dǎo)該制劑臨床合理用藥、 保證有效性和安全性提供科學(xué)依據(jù)。

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