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    回陽固元方對人乳頭瘤病毒感染細(xì)胞凋亡的影響研究*

    2019-08-22 08:49:14曹萍朱偉楊同華
    關(guān)鍵詞:回陽蓋玻片角質(zhì)

    曹萍,朱偉,楊同華

    (1.云南省第一人民醫(yī)院 皮膚科,云南 昆明 650032;2.昆明理工大學(xué),云南 昆明 650504)

    人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一種小分子DNA病毒,容易吸附在人體皮膚及黏膜誘發(fā)疾病。尖銳濕疣(condyloma acuminatum,CA)是由HPV感染引起的生殖器皮膚增生性疾病,也是性傳播疾病的一種,其發(fā)病率在我國性傳播疾病中位居前列,在性接觸較高的歐美國家,其發(fā)病率更高。因此,CA受到全球?qū)W者的廣泛關(guān)注[1-2]。

    回陽固元方由回陽飲演化而來,回陽飲為清代四川名醫(yī)鄭欽安治療下元虧損而設(shè),以此為基礎(chǔ),云南省已故著名溫陽大家吳附子吳佩衡先生創(chuàng)制大回陽飲[3],臨床上對多種中西醫(yī)難治的疾病療效頗佳。該方含附子、干姜,附子為第一溫陽藥,國內(nèi)知名的溫陽大家吳附子吳榮祖先生繼續(xù)發(fā)展為回陽固元方,對包括CA在內(nèi)的難治性疾病的療效有很大提高。本研究用不同濃度的回陽固元方,探討該方的扶正作用對HPV感染細(xì)胞凋亡的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    標(biāo)本皮膚組織取自云南省第一人民醫(yī)院皮膚科CA患者局部切除的皮損(HPV感染組)。正常組皮膚組織為本院泌尿外科正常人包皮切除組織。器材一次性塑料培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板及塑料凍存管2 ml(美國Corning公司),常規(guī)手術(shù)器械(淮安市醫(yī)療用品廠),0.22 μm微孔濾器(美國Millipore公司),熒光定量PCR儀 CFX96(美國BIO-RAD公司),超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)州安泰空氣技術(shù)有限公司),5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Heraeus公司),倒置顯微鏡(日本Nikon公司),酶標(biāo)儀(奧地利Clini Bio公司),直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板(美國Falcon公司);流式細(xì)胞儀FACS Calibur(美國 Becton Dicknson 公司)。

    胰酶、PBS、青鏈霉素(以色列BI公司),熒光定量PCR試劑盒:CWBIO CW09570,RNase(美國Sigma公司),胰酶抑制劑、限制性角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司),DispaseⅡ(瑞士ROCHE公司)。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)、蘇木精、細(xì)胞角蛋白(廣譜)CK(Pan)、鼠抗人單克隆抗體及二抗生物素標(biāo)記的兔抗鼠IgG(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。Caco-2細(xì)胞購置于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

    1.2 方法

    1.2.1 CA 患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定、細(xì)胞周期的檢測參照文獻(xiàn)[4]。

    1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡對于貼壁細(xì)胞,可將細(xì)胞直接接種于蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。將回陽固元方不同藥物濃度作用后的角質(zhì)形成細(xì)胞采用細(xì)胞爬片的形式生長于蓋玻片,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并設(shè)立陰性對照組;取出蓋玻片然后用PBS沖洗細(xì)胞2次,沖洗過程中不宜過于激烈以免沖走細(xì)胞;在500 μl緩沖液中加入5 μl磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V-FITC),5 μl碘化丙啶(propidium lodide,PI)混勻 ;將上述溶液滴加于蓋玻片表面,使蓋玻片表面均勻覆蓋、避光,室溫反應(yīng)5 min。將蓋玻片倒置于載玻片,于熒光顯微鏡下、雙色濾光片(FITC和羅丹明)觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色,PI熒光信號呈紅色。檢測的細(xì)胞凋亡結(jié)果中,UL區(qū)為壞死細(xì)胞區(qū),LL區(qū)為細(xì)胞存活區(qū),LR區(qū)為早期凋亡區(qū),UR區(qū)為晚期凋亡區(qū),細(xì)胞凋亡率=(LR+UR)/LL,以此統(tǒng)計(jì)不同濃度、時間段的細(xì)胞凋亡率。

    1.2.3 人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2 模型的建立 將Caco-2細(xì)胞接種于轉(zhuǎn)運(yùn)池(Transwell)中的微孔濾膜上可形成單層細(xì)胞層,是用來模擬小腸上皮細(xì)胞層的吸收模型,該濾膜可由硝酸纖維素或者多聚碳酸酯制成。由于多聚碳酸酯膜不會形成藥物擴(kuò)散過程中的屏障,所以常選用多聚碳酸酯膜作為細(xì)胞單層模型的支架。取出冷凍的Caco-2細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速融化,用吸管吹打成單細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)入15 ml離心管中,加入含10%胎牛血清的新鮮DMEM(高糖)培養(yǎng)基,混勻后 1 200 r/min離心5 min,棄上清液,再加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,充分吹打成單細(xì)胞懸液,再混勻后1 000 r/min離心 5 min,棄上清液,加入適量含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸,吹打,調(diào)整細(xì)胞密度在2×105~5×105個/L左右,然后接種于 TranswellTM細(xì)胞培養(yǎng)皿中(2 ml/孔),共6孔,在培養(yǎng)皿的下腔加入1 ml的DMEM培養(yǎng)基,放入37℃、5% CO2濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天取出細(xì)胞,顯微鏡觀察細(xì)胞的生長貼壁情況,棄出舊培養(yǎng)基,并加入新鮮培養(yǎng)基,然后拍照記錄,以后培養(yǎng)過程中每隔1天更換1次培養(yǎng)基,并持續(xù)觀察細(xì)胞生長狀。結(jié)果表明,Caco-2細(xì)胞約在接種后1周長至培養(yǎng)皿的70%~80%,再持續(xù)培養(yǎng)才可以長滿至整個培養(yǎng)皿。通過對Caco-2細(xì)胞長滿后每個孔的觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合成完整的細(xì)胞層,細(xì)胞間連接緊密;該細(xì)胞形態(tài)與小腸上皮細(xì)胞極為相似,從形態(tài)學(xué)上可以確定所培養(yǎng)細(xì)胞為Caco-2細(xì)胞,細(xì)胞單層膜完整性較好,可用于藥物吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.4 回陽固元方的制備回流提取法在應(yīng)用乙醇等易揮發(fā)的有機(jī)溶劑作為溶媒提取中藥中有效成分時,為減少溶媒的使用量和溶媒的消耗,而采用加熱提取,是使溶媒揮發(fā)冷卻后重新回流至鍋內(nèi)的一種方法。秤取制附子 20g,干姜 15g,肉桂 10g,炙甘草 15g,麻黃10g,細(xì)辛3g,將秤取好的中藥材加工成細(xì)段或者粗粉放入多功能提取罐中,加入5倍量蒸餾水浸泡30min,用夾層蒸汽加熱,并及時打開冷凝器的冷卻水,沸騰時要先排除罐內(nèi)空氣,否則會使鍋內(nèi)帶壓,再關(guān)閉排氣閥。60min后收集濾液,將濾液回流抽提30min,過濾,加入3倍量的蒸餾水回流抽提30min,過濾,低溫低壓濃縮成 1g/ml的提取液共 50ml,經(jīng) 3500 r/min 離心5min,離心 3 次,再以 13000 r/min 離心 5min,離心3次,最后用0.45μm濾膜過濾,4℃密封無菌保存,使用前再用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。經(jīng)回流抽提得到回陽固元方的濃縮液,低溫低壓再濃縮成1g/ml的提取液,稀釋成5個濃度梯度,分別是5、10、20、40及80μg/ml。作用于目標(biāo)細(xì)胞時分5個時間段,分別是12、24、48、72及96h,然后測得不同中藥濃度和不同時間段的細(xì)胞指標(biāo)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)(ANOVA)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CA皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞

    正常組皮膚組織獲得的單細(xì)胞懸液,在光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞呈典型的上皮樣特征,呈鋪路石狀,細(xì)胞核較大,且可見含有多個細(xì)胞核的細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有較多顆粒,細(xì)胞排列緊密折光性較好。CA皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)制成的單細(xì)胞懸液,細(xì)胞形態(tài)無鋪路石狀,細(xì)胞近似圓形,可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)。見圖1、2。

    2.2 Caco-2細(xì)胞

    Caco-2細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則狀,細(xì)胞排列緊密,具有微絨毛結(jié)構(gòu),類似于小腸上皮細(xì)胞。Transwell(轉(zhuǎn)運(yùn)池)建立,Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于多聚碳酸酯膜上,排列緊密后使藥物透過Caco-2細(xì)胞層作用于目標(biāo)細(xì)胞或者收集透過后的濾液無菌保存,供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。見圖3、4。

    2.3 細(xì)胞凋亡

    經(jīng)HPV感染的角質(zhì)形成細(xì)胞其凋亡率有所降低。見圖5、6。

    圖1 正常角質(zhì)形成細(xì)胞 (×200)

    圖2 CA 皮損角質(zhì)形成細(xì)胞 (×200)

    圖3 Caco-2 細(xì)胞 (×200)

    圖4 Transwell (轉(zhuǎn)運(yùn)池)

    固定48h后,不同藥物濃度HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=159.932,P=0.000),隨著中藥濃度的增加,凋亡率逐漸增加;固定藥物濃度20μg/ml后,不同作用時間HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=140.794,P=0.000),隨著時間的增加,角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。見表1、2。

    圖5 正常角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

    圖6 感染角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

    表1 48 h不同藥物濃度HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率

    表2 20 μg/ml不同作用時間HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率

    3 討論

    角質(zhì)形成細(xì)胞受損可引起多種疾病,而CA是其中較嚴(yán)重的一種,目前其根除性治療仍是臨床中的一大難題[5]。在CA的發(fā)病過程中,角質(zhì)形成細(xì)胞出現(xiàn)諸多變化,如何調(diào)整角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期是解決CA治療的關(guān)鍵所在[6]。1975年RHEINWALD和GREEN[7]首次在體外成功培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞,該里程碑式的成就為人類修復(fù)皮膚缺損奠定基礎(chǔ)。1981年O'CONNOR培養(yǎng)適于移植的人自體表皮細(xì)胞膜片[8],為體外構(gòu)建組織工程皮膚及臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是關(guān)于角質(zhì)形成細(xì)胞周期的研究甚少,如何闡述細(xì)胞周期與CA的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性,是未來研究CA治療的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn),CA皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞在培養(yǎng)過程中易受白假絲酵母菌的污染,連續(xù)傳代及反復(fù)凍融都會破壞其細(xì)胞固有的生物學(xué)特性[9]。在檢測CA發(fā)病前后角質(zhì)形成細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn),感染HPV后的角質(zhì)形成細(xì)胞其周期縮短,導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),使感染者快速出現(xiàn)皮損。臨床中常用直接去除疣體的辦法來治療CA,但治標(biāo)不治本,CA仍有較高的復(fù)發(fā)率。宿主局部免疫抑制和對HPV蛋白的異常識別導(dǎo)致的病毒免疫逃逸和持續(xù)感染是HPV感染相關(guān)疾病難以根治的主要原因[10]。

    關(guān)于CA的中醫(yī)治療,國內(nèi)外研究得不多[11],而且?guī)缀跏且郧鍩岢凉耢钚盀橹?,扶正固本者較少,中醫(yī)抗HPV感染的治療應(yīng)抓住主流本質(zhì)。本課題用極富云南特色的回陽固元方來誘導(dǎo)馴化HPV感染的角質(zhì)形成細(xì)胞,利用人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2模型模擬人體小腸上皮細(xì)胞[12],類似人體內(nèi)環(huán)境,更接近于中藥的體內(nèi)吸收過程。通過測定中藥作用后CA皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn),隨著作用時間和中藥濃度的增加,角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率呈逐漸增加的趨勢,說明回陽固元方的扶正作用可誘導(dǎo)馴化患者皮損處的角質(zhì)形成細(xì)胞,促使其細(xì)胞凋亡。

    CA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,深入研究其發(fā)病機(jī)制對與皮損角質(zhì)形成細(xì)胞有關(guān)的皮膚病有著重要的理論和實(shí)踐意義,提示可以從細(xì)胞凋亡的途徑來治療相關(guān)的皮膚病,為其治療開辟新的領(lǐng)域。

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