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    基于COⅠ基因探討北京及其周邊地區(qū)跳鉤蝦種群遺傳結(jié)構(gòu)

    2019-08-22 01:07:46崔昕宇劉宏廣李樞強(qiáng)
    四川動(dòng)物 2019年4期
    關(guān)鍵詞:支系種群分化

    崔昕宇, 劉宏廣, 李樞強(qiáng)*

    (1. 中國(guó)人民大學(xué)附屬中學(xué),北京100080;2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所,北京100101)

    跳鉤蝦Platorchestiajaponica隸屬于甲殼動(dòng)物亞門(mén)Crustacea端足目Amphipoda跳鉤蝦科Talitridae,是唯一一種棲息在湖泊、河流沿岸的陸生鉤蝦,主要分布于我國(guó)北京、河北、山西、陜西、山東,以及日本和朝鮮等(Hou & Li,2003)。跳鉤蝦具有抱卵行為,沒(méi)有自由的幼體階段,遷移能力較弱,其遷移必須借助水系的連通或者水生植物的攜帶。研究表明,陸生跳鉤蝦起源于海洋類(lèi)群,是由于中新世東亞海入侵驅(qū)動(dòng)其占據(jù)陸生生境,并在陸生生境中快速分化(Yangetal.,2013;楊璐等,2013)。跳鉤蝦的種群遺傳學(xué)研究較少,Cheng等(2011)基于形態(tài)和線(xiàn)粒體COⅠ基因序列的研究發(fā)現(xiàn),中國(guó)臺(tái)灣跳鉤蝦與日本和中國(guó)大陸的跳鉤蝦存在顯著分化,可能為一個(gè)新種Platorchestiapaludosus。中國(guó)內(nèi)陸跳鉤蝦的地理格局和種群遺傳結(jié)構(gòu)還未見(jiàn)報(bào)道。

    線(xiàn)粒體COⅠ基因是一段蛋白質(zhì)編碼基因,易擴(kuò)增、好比對(duì),進(jìn)化速率較快,已被廣泛用于種群水平的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究(董夢(mèng)書(shū)等,2017)。本研究通過(guò)采集北京及其周邊地區(qū)的跳鉤蝦樣品,進(jìn)行COⅠ基因的序列測(cè)定,分析其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性,探討系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及分化過(guò)程。

    1 材料與方法

    1.1 樣品的采集、保存和鑒定

    跳鉤蝦野外采集直接用紗網(wǎng)沿草叢根部掃網(wǎng),將新鮮樣品浸泡于95%酒精中,當(dāng)天更換酒精1次,-20 ℃長(zhǎng)期保存。本研究共收集到北京、河北、山西、陜西、山東等地22個(gè)采集點(diǎn)128只跳鉤蝦(表1)。

    表1 跳鉤蝦樣品采集信息Table 1 Sampling information of Platorchestia japonica

    1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

    取跳鉤蝦頭部,使用TIANamp Genomic DNA試劑盒提取總DNA,按照說(shuō)明書(shū)操作。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    線(xiàn)粒體COⅠ基因擴(kuò)增引物為CrustF2(5’-GGTTCTTCTCCACCAACCACAARGAYA-3’; Costaetal.,2007)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAA-AAAATCA-3’; Folmeretal.,1994)。PCR反應(yīng)體系為25 μL:2.5 μL 10×buffer PCR緩沖液,2 μL 2.5 mmol·L-1dNTP混合液,1 μL 10 pmol正、反向引物,0.15 μL Taq酶(5 U·μL-1),17.35 μL ddH2O,1 μL DNA模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s,45 ℃ 90 s,72 ℃ 1 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s,51 ℃ 90 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),回收產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司用ABI3730測(cè)序儀雙向測(cè)序。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    獲得的測(cè)序峰圖利用Sequencher 4.5進(jìn)行正反鏈校對(duì)和編輯,刪除序列兩端的引物區(qū);運(yùn)用MacClade 4.0(Maddison & Maddison,2000)進(jìn)行序列比對(duì),并翻譯成氨基酸檢查是否存在假基因,有效序列形成數(shù)據(jù)矩陣。使用MEGA 7.0.21(Kumaretal.,2016)分析堿基組成、變異位點(diǎn),并計(jì)算遺傳距離(p-distance)。選取Platorchestiapacifica(COⅠ基因GenBank登錄號(hào):KC578473)、Platorchestiajoi(COⅠ基因GenBank登錄號(hào):KC578512)為外群,采用最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。ML分析用raxmlGUI 1.5b2(Silvestro & Michalak,2012),通過(guò)1 000次自展值檢驗(yàn)計(jì)算支持率。BI分析用MrBayes 3.2.2(Ronquistetal.,2012),以jModeltest 2.1.7(Posada,2008)所得最適模型參數(shù)Nst=6,運(yùn)算400萬(wàn)代,每1 000代取樣1次,去掉25%burnin,最終用收斂后的3 000棵樹(shù)構(gòu)建一致樹(shù)。采用DnaSP 6.12統(tǒng)計(jì)種群遺傳多樣性參數(shù)(Rozasetal.,2017),使用Arlequin 3.5進(jìn)行分子變異分析(Excoffier & Lischer,2010)。運(yùn)用PopART 1.7(Leigh & Bryant,2015)中最小生成網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,分析單倍型間的進(jìn)化關(guān)系。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 序列分析

    共獲取了128個(gè)跳鉤蝦樣本COⅠ基因部分序列(GenBank登錄號(hào):MK048335~MK048350、MK048352~MK048365、MK048368、MK048370~MK048371、MK048374~MK048386、MK286468~MK286549),序列長(zhǎng)度為623 bp,其中,保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)分別為567個(gè)、56個(gè)和38個(gè)。序列中無(wú)插入和缺失,T、C、A、G平均含量分別為38.1%、18.5%、25.3%、18.1%,A+T含量較高(63.4%);G+C在密碼子第三位點(diǎn)的平均含量為19.5%,明顯低于第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)(47.9%和42.3%)。全部序列檢測(cè)到43個(gè)單倍型。

    2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)分析

    采用ML和BI法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致(圖1)。43個(gè)跳鉤蝦單倍型分化為2個(gè)進(jìn)化支,來(lái)自北京東部、山西、陜西、河北、山東和北京西部的1個(gè)單倍型形成一支,來(lái)自北京西部的另外6個(gè)單倍型形成一支。

    單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示出與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)相同的結(jié)果,跳鉤蝦的43個(gè)單倍型分化為2個(gè)進(jìn)化支,支系間有明顯的遺傳變異。北京東部及山西等地的支系包括36個(gè)單倍型,其中Hap1為最大共享單倍型,其他單倍型由Hap1通過(guò)一步或多步突變演化而來(lái)。北京西部支系包括6個(gè)特有單倍型,Hap16位于網(wǎng)絡(luò)中心,其余5個(gè)單倍型與Hap16相差1個(gè)或2個(gè)突變距離。Hap4為北京東部等地支系與北京西部支系共享單倍型。

    2.3 遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)

    跳鉤蝦整體單倍型多樣性為0.938,核苷酸多樣性為0.011 72(表1)。Hap1出現(xiàn)頻次最高(23),包括北京東部(包括圓明園、昌平區(qū)沙河水庫(kù)、海淀區(qū)玉泉山、奧林匹克公園)、河北省靈壽縣牛城鄉(xiāng),以及陜西省涇陽(yáng)縣王橋鎮(zhèn)共享單倍型。Hap16為北京西部3個(gè)采樣點(diǎn)共享單倍型,出現(xiàn)頻次為14。

    Hap4為北京市延慶區(qū)官?gòu)d水庫(kù)與河北省永年縣廣府鎮(zhèn)共享單倍型,除此之外,2個(gè)采樣點(diǎn)各自有特有單倍型,河北省永年縣廣府鎮(zhèn)的3個(gè)樣品中有2個(gè)樣品共享單倍型Hap3,北京市延慶區(qū)官?gòu)d水庫(kù)的4個(gè)樣品中有2個(gè)樣品共享單倍型Hap16和Hap17,2個(gè)種群間的Fst值為0.522 6。

    圖1 跳鉤蝦采樣點(diǎn)和基于COⅠ基因單倍型構(gòu)建的最大似然樹(shù)/貝葉斯樹(shù)
    Fig. 1 The sampling sites ofPlatorchestiajaponicaand the Maximum Likelihood tree/Bayesian tree based onCOⅠgene haplotypes

    a. 跳鉤蝦采樣點(diǎn), 樣點(diǎn)編號(hào)同表1; B. 跳鉤蝦生態(tài)照(劉宏廣 攝); C. 跳鉤蝦最大似然樹(shù)和貝葉斯樹(shù), 分支上的數(shù)字分別是最大似然和貝葉斯支持率

    a. Sampling sites ofP.japonica, with numbers the same as those in table 1; B. Photo ofP.japonica(photo by Liu Hongguang); C. Maximum Likelihood and Bayesian tree ofP.japonica, numbers above the branches represent support values in ML/BI analyses, respectively

    2.4 遺傳距離和遺傳分化系數(shù)

    跳鉤蝦2個(gè)遺傳支系間遺傳距離為0.029±0.006,支系內(nèi)遺傳距離均為0.004±0.001。

    分子變異分析結(jié)果顯示,2個(gè)支系間的遺傳變異組分為7.758 43,種群內(nèi)變異組分為1.345 71,二者占總遺傳變異組分的比率分別為85.22%、14.78%,F(xiàn)st值達(dá)到0.852 19,二者差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

    圖2 基于COI基因的跳鉤蝦單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 The haplotype network of Platorchestia japonicabased on COI sequences

    圓圈代表單倍型, 大小與單倍型頻率呈正比, 顏色與圖1相同, 紅色代表北京東部支系, 藍(lán)色代表北京西部支系; 小豎線(xiàn)代表突變; Hap4是北京東部支系與北京西部支系的共享單倍型, 單倍型與地理分布之間沒(méi)有嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系

    Each circle means a haplotype, and the size of circles is proportional to haplotype frequency, color annotation is the same as that in fig. 1; red. east part of Beijing, blue. west part of Beijing; each short line represents one mutation step; haplotypes from geographical populations showed no apparent distinct genetic clade

    3 討論

    線(xiàn)粒體COⅠ基因不受標(biāo)本性別、發(fā)育階段的限制,在種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析中得到廣泛應(yīng)用(董夢(mèng)書(shū)等,2017)。遺傳多樣性是物種多樣性的基礎(chǔ),是物種生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提(李大命等,2018)。跳鉤蝦22個(gè)采樣點(diǎn)128只個(gè)體中共檢測(cè)到43個(gè)單倍型,單倍型多樣性為0.938,核苷酸多樣性為0.011 72,顯示出較高的遺傳多樣性,遺傳資源豐富,可以篩選環(huán)境敏感型表型,用作環(huán)境毒物監(jiān)測(cè)(Duanetal.,2000)。

    跳鉤蝦地理遺傳結(jié)構(gòu)報(bào)道很少,盡管Cheng等(2011)的研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的跳鉤蝦與日本和中國(guó)大陸跳鉤蝦在形態(tài)和遺傳上有顯著的分化,但隨后更廣泛的研究結(jié)果表明跳鉤蝦并沒(méi)有顯著的地理種群遺傳結(jié)構(gòu)(Yangetal.,2013)。北京西部地區(qū)大部分單倍型形成一個(gè)單系群,但北京東部和西部并沒(méi)有明顯的地理阻隔,綜合北京西部的聚類(lèi)以及北京東部和西部仍然存在共享單倍型,這種聚類(lèi)可能由非地理遺傳差異引起,如取樣的局限性等,北京地區(qū)跳鉤蝦存在東西遺傳阻隔的可能性小,北京周邊地區(qū)跳鉤蝦是否存在地理種群遺傳結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步研究。本研究中,系統(tǒng)發(fā)育和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析都支持跳鉤蝦分化為2個(gè)進(jìn)化支。一支主要包括北京東部、山西、陜西、河北和山東等地的單倍型,分支內(nèi)各單倍型間存在1個(gè)或多個(gè)堿基突變;另一支主要包括北京西部延慶、門(mén)頭溝等地的單倍型,分支內(nèi)各單倍型間存在1個(gè)或2個(gè)堿基替代;兩分支存在16個(gè)堿基變異。分子變異分析顯示跳鉤蝦兩支系間Fst值(0.852 19)較高,按照Wright(1965)認(rèn)為Fst值大于0.15為高度遺傳分化,意味著檢測(cè)區(qū)域的跳鉤蝦可能來(lái)源于2個(gè)遺傳不同的地理種群。Yang等(2013)在中國(guó)大陸及臺(tái)灣地區(qū)更廣泛的取樣基于COⅠ基因的研究結(jié)果表明,跳鉤蝦地理種群結(jié)構(gòu)不明顯,但明顯分成2個(gè)遺傳不同的進(jìn)化支,這表明目前的跳鉤蝦可能存在2個(gè)遺傳不同的種群來(lái)源。已有研究表明,更新世冰期事件成為影響該地域動(dòng)物種群遺傳分化和遺傳多樣性的主要原因(白茜茜等,2018),跳鉤蝦在冰期是否存在2個(gè)不同的大避難所,以及避難所的位置及冰期后的遷移擴(kuò)散等還需要進(jìn)一步的研究。

    本研究運(yùn)用線(xiàn)粒體COⅠ基因探討了北京及其周邊地區(qū)跳鉤蝦的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu),研究發(fā)現(xiàn)跳鉤蝦遺傳多樣性高,遺傳資源豐富,跳鉤蝦群體存在2個(gè)遺傳不同的進(jìn)化支,表明目前的跳鉤蝦具有2個(gè)來(lái)源。本研究在北京及周邊地區(qū)采集了128個(gè)樣本,鑒定了43個(gè)COⅠ基因序列單倍型,為中國(guó)地區(qū)跳鉤蝦種群遺傳結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究提供了重要的基礎(chǔ)資料。

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