井岡霉素、多菌靈和不動(dòng)桿菌A2混用對(duì)水稻紋枯病病菌的抑制作用

朱彤彤 陳達(dá)川 袁夢(mèng)思

摘要：為探索能夠高效防治水稻紋枯病的方法，以水稻紋枯病菌強(qiáng)致病菌株A111為供試菌株，通過室內(nèi)平板試驗(yàn)測(cè)定井岡霉素、多菌靈和不動(dòng)桿菌A2混用對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用。結(jié)果表明，井岡霉素對(duì)水稻紋枯病菌的毒力較大，其EC50為0.026 4 mg/L;多菌靈的EC50為0.183 5 mg/L。研究發(fā)現(xiàn)，井岡霉素處理后的水稻紋枯病菌菌落呈不規(guī)則形態(tài)生長(zhǎng)，菌絲和菌核的干質(zhì)量隨藥劑濃度增加明顯下降;而多菌靈處理后的水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌絲和菌核的干質(zhì)量降低程度低于井岡霉素。而井岡霉素、多菌靈與不動(dòng)桿菌A2混用后對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用均高于單獨(dú)使用時(shí)的效果。由此可見，將井岡霉素和多菌靈與不動(dòng)桿菌A2混用能夠更好地防治水稻紋枯病，為殺菌劑和生防菌的混用奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：井岡霉素;多菌靈;不動(dòng)桿菌;水稻紋枯病菌;生防菌混用

中圖分類號(hào)： S435.111.4+2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0146-03

水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起，在南方稻區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，是水稻上的主要病害之一，給水稻生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。對(duì)于水稻紋枯病的防治，主要采用化學(xué)藥劑。其中，井岡霉素和多菌靈屬于高效低毒的廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)并使用以來(lái)，對(duì)水稻紋枯病的防治達(dá)到了顯著的效果。但由于藥劑的不合理使用及長(zhǎng)期使用單一殺菌劑，造成菌株產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性[4-6]。

生物防治是一種高效、安全的防治植物病害的方法，而且不污染環(huán)境，從而受到了人們的青睞，先后發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、放線菌（Actinomycetes）等常見的紋枯病拮抗菌[7-9]。但生防菌易受到不適宜土壤環(huán)境及其本身特性的影響，很難達(dá)到預(yù)期的防病效果。有研究證實(shí)，將殺菌劑和生防菌混合使用，可以有效延緩紋枯病菌的抗藥性，提高對(duì)水稻紋枯病的防治效果[10-11]。筆者在獲得1株高效拮抗水稻紋枯病菌的不動(dòng)桿菌A2的基礎(chǔ)上[12]，仍以水稻紋枯病強(qiáng)致病菌株A111為供試菌株，在室內(nèi)測(cè)定井岡霉素和多菌靈及其與不動(dòng)桿菌A2混用后對(duì)紋枯病菌的抑制作用，旨在為深入探索殺菌劑和生防菌混用對(duì)水稻紋枯病的作用機(jī)制和提高防治效果提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 水稻紋枯病菌A111、不動(dòng)桿菌A2均由長(zhǎng)江大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室采集、分離和純化。

1.1.2 供試藥劑 5%井岡霉素A可濕性粉劑（武漢科諾生物科技有限公司）、25%多菌靈可濕性粉劑（山東省禾宜生物科技有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水補(bǔ)足至1 000 mL，pH值自然;馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水補(bǔ)足至1 000 mL，pH值自然;營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水補(bǔ)足至 1 000 mL，pH值7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥劑毒力測(cè)定 將2種藥劑分別加入到融化好的PDA培養(yǎng)基中，使井岡霉素濃度為0、0.048、0.096、0.192、0.384、0.768 mg/L，多菌靈濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L。將培養(yǎng)48 h的水稻紋枯病菌菌塊（直徑7 mm）接種至含藥的PDA培養(yǎng)基中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后依照十字交叉法測(cè)定各個(gè)處理的菌落直徑，以不含藥劑的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)3次。通過菌絲生長(zhǎng)抑制率和各藥劑的有效濃度對(duì)數(shù)值之間的線性回歸分析，求出各藥劑的EC50值和EC90值。抑制率的計(jì)算公式如下：

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.2 菌落與菌絲形態(tài)觀察 將直徑7 mm的水稻紋枯病菌菌塊分別接種到上述藥劑濃度的PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃培養(yǎng)。24 h后用插片培養(yǎng)法[13]添加蓋玻片，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，蘇木精染色，采用倒置顯微鏡觀察，每個(gè)濃度重復(fù)3次。觀察并記錄不同濃度井岡霉素和多菌靈處理的菌落和菌絲的形態(tài)，并比較其差異。

1.2.3 菌核、菌絲干質(zhì)量的測(cè)定 采用“1.2.2”節(jié)的方法，28 ℃ 培養(yǎng)15 d，收集菌核，烘干后稱其質(zhì)量，每個(gè)濃度重復(fù)3次。

將2種藥劑分別加入裝有100 mL PD培養(yǎng)基的三角瓶中，使井岡霉素和多菌靈濃度如“1.2.1”節(jié)所述。每瓶接種10塊水稻紋枯病菌菌塊（直徑7 mm），每個(gè)濃度重復(fù)3次，以不加藥劑的培養(yǎng)基為對(duì)照，于28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，用布氏漏斗過濾收集菌絲體，烘干，稱質(zhì)量。

1.2.4 井岡霉素、多菌靈和不動(dòng)桿菌A2混用對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用 將不動(dòng)桿菌A2在NA培養(yǎng)基上劃線后，挑取單菌落于5 mL NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min過夜培養(yǎng)。分別配制含有不同濃度井岡霉素、多菌靈的PDA培養(yǎng)基，將直徑7 mm的水稻紋枯病菌菌塊接種至中央，在距離菌塊約2 cm處接種不動(dòng)桿菌菌液，培養(yǎng)2 d后，以十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。以不動(dòng)桿菌和紋枯病菌的混合接種及只接種紋枯病菌為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 井岡霉素和多菌靈的毒力測(cè)定結(jié)果

由表1可見，井岡霉素對(duì)水稻紋枯病菌的毒力強(qiáng)于多菌靈，其EC50值為0.026 4 mg/L，而多菌靈的EC50值為 0.183 5 mg/L。測(cè)定2種藥劑的EC90結(jié)果表明，兩者的毒力相當(dāng)，分別為0.440 8、0.459 0 mg/L，均可以用來(lái)防治水稻紋枯病。

2.2 井岡霉素和多菌靈對(duì)菌落形態(tài)的影響

由圖1中的A1至A6可以看出，在含有不同濃度井岡霉素的培養(yǎng)基上，水稻紋枯病菌生長(zhǎng)緩慢，菌落邊緣凹凸不平，菌絲更為密集，且隨著濃度的增加菌落直徑明顯減小，甚至停止生長(zhǎng);而在對(duì)照培養(yǎng)基上，病菌生長(zhǎng)良好，菌落形態(tài)規(guī)則。同樣，由B1至B6可知，多菌靈也能夠引起水稻紋枯病菌生長(zhǎng)慢、菌落不規(guī)則和菌絲稀疏，但兩者對(duì)水稻紋枯病菌菌落形態(tài)的影響明顯不同。

2.2 井岡霉素和多菌靈對(duì)菌絲形態(tài)的影響

倒置顯微鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，井岡霉素和多菌靈處理后的水稻紋枯病菌菌絲分支增多、彎曲、畸形腫大、原生質(zhì)滲漏、細(xì)胞核分布不均勻等，而未經(jīng)處理的水稻紋枯病菌菌絲細(xì)長(zhǎng)、原生質(zhì)均勻、節(jié)間距大（圖2）。從菌絲形態(tài)來(lái)看，井岡霉素對(duì)水稻紋枯病菌菌絲的影響明顯強(qiáng)于多菌靈。

2.3 井岡霉素和多菌靈對(duì)菌核和菌絲干質(zhì)量的影響

由表2可知，隨井岡霉素和多菌靈濃度增大，水稻紋枯病菌菌核和菌絲的干質(zhì)量均明顯下降。更重要的是，隨藥劑濃度增大，在單位面積培養(yǎng)基上的菌核數(shù)量卻有所增加。研究還發(fā)現(xiàn)，井岡霉素在較低濃度時(shí)就可達(dá)到抑制菌核和菌絲生長(zhǎng)的效果（數(shù)據(jù)略），這可能與井岡霉素抑菌效率較高有關(guān)系。

2.4 井岡霉素、多菌靈和不動(dòng)桿菌A2混用對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用

由表3可知，不同濃度的井岡霉素和多菌靈與不動(dòng)桿菌A2混合處理水稻紋枯病菌后，其抑制效果均高于井岡霉素、多菌靈和不動(dòng)桿菌A2單獨(dú)處理。0.768 mg/L井岡霉素與不動(dòng)桿菌A2混合處理抑菌率高達(dá)94.23%，而且井岡霉素與不動(dòng)桿菌A2混用的抑菌效果略高于多菌靈與A2混用的效果。

3 結(jié)論與討論

目前，井岡霉素是防治水稻紋枯病高效、經(jīng)濟(jì)、與環(huán)境相容性較好的抗生素農(nóng)藥;多菌靈是苯并咪唑類殺菌劑，能夠與病原真菌的微管蛋白相結(jié)合，抑制細(xì)胞的有絲分裂，可以用來(lái)防治水稻紋枯病。但由于長(zhǎng)期單一使用井岡霉素，導(dǎo)致水稻紋枯病菌產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗性[14-15]。為此，研究不同濃度的井岡霉素和多菌靈對(duì)水稻紋枯病菌生長(zhǎng)發(fā)育的影響具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，井岡霉素和多菌靈均能抑制水稻紋枯病菌的生長(zhǎng)，且井岡霉素防治效果要好一些，這與前人研究結(jié)果[16]基本一致。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，隨著井岡霉素和多菌靈濃度的增加，水稻紋枯病菌菌核和菌絲的干質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，但單位面積菌核數(shù)量有所增加，這與楊媚等的研究結(jié)果[17]有所不同，這可能與水稻紋枯病菌的菌核形成機(jī)制有關(guān)。

關(guān)于多菌靈的防病機(jī)制研究比較成熟，普遍認(rèn)為能夠抑制病原菌的微管形成，從而導(dǎo)致病原菌不能增殖。而對(duì)于井岡霉素的防病機(jī)制則認(rèn)為其不能殺死水稻紋枯病菌，但能抑制菌絲生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌絲畸形而影響其致病力，并可誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗性防衛(wèi)反應(yīng)[18]。本試驗(yàn)結(jié)果證明了井岡霉素和多菌靈均能引起水稻紋枯病菌菌絲的畸形和緩慢生長(zhǎng)，從而防治病害的發(fā)生，但其對(duì)水稻植株防衛(wèi)反應(yīng)的影響等還需進(jìn)一步研究。同時(shí)，為了減輕和避免水稻紋枯病菌抗藥性的產(chǎn)生，可以采取與生物防治相結(jié)合的方法。本研究結(jié)果表明，井岡霉素、多菌靈與不動(dòng)桿菌A2混用后對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用均高于單獨(dú)使用時(shí)的效果，與張科等的研究結(jié)果[19-21]基本一致，為更高效地防治水稻紋枯病奠定了理論基礎(chǔ)。

總而言之，井岡霉素和多菌靈都可以用來(lái)單獨(dú)防治水稻紋枯病，且前者的防病效果更好一些。而井岡霉素、多菌靈與不動(dòng)桿菌A2混用后對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用均高于單獨(dú)使用時(shí)的效果。筆者認(rèn)為，對(duì)水稻紋枯病菌的綜合防治已經(jīng)刻不容緩，今后需要加大對(duì)其抗藥性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、抑菌機(jī)制的探索以及多種殺菌劑混用的研究，進(jìn)一步提高防治效果。

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