農(nóng)藥多菌靈降解菌的分離及其降解效能研究

冀玉良，劉明勤，齊家樂

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

目前化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的過度施用以及連作導(dǎo)致的土壤自凈化能力的降低，致使農(nóng)產(chǎn)品及土壤農(nóng)藥殘留問題日益突出[1]，殘留農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類身體健康構(gòu)成巨大的威脅。多菌靈是一種氨基甲酸甲酯類殺菌劑，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較長(zhǎng)[2-4]，能夠持久地殘留在土壤中，過量使用不僅會(huì)改變土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)，使土壤肥力下降，還會(huì)對(duì)土壤中的無(wú)脊椎動(dòng)物造成嚴(yán)重危害，已有研究表明，多菌靈對(duì)人的神經(jīng)細(xì)胞、生殖細(xì)胞都有毒害作用[5-6]。微生物具有強(qiáng)大的物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化能力，將降解特定農(nóng)藥的微生物引入到污染土壤中不僅能有效降低殘留農(nóng)藥濃度，使土壤恢復(fù)健康狀態(tài)，而且此方法綠色環(huán)保、不會(huì)產(chǎn)生二次污染。目前已有很多文獻(xiàn)報(bào)道篩選到了一些在搖瓶發(fā)酵中對(duì)多菌靈降解能力較強(qiáng)的菌株，然而這些菌株在盆栽尤其是在田間試驗(yàn)中的降解效果并不理想[1]，其原因可能與菌株不能耐受土壤復(fù)雜的生境有關(guān)。本研究采用唯一碳源富集培養(yǎng)和平板劃線純化法，從商州區(qū)劉灣長(zhǎng)期使用多菌靈的蔬菜種植基地土壤中篩選對(duì)多菌靈具有高效降解能力的降解菌株，并研究其生理生化特性、生長(zhǎng)特性和耐鹽性以及不同條件對(duì)菌株降解多菌靈效果的影響，為解決土壤中農(nóng)藥多菌靈的殘留問題提供有效功能菌和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和藥劑

供試土壤樣品：采自商州區(qū)劉灣長(zhǎng)期使用多菌靈的連作蔬菜基地。

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）和測(cè)多菌靈殘留量標(biāo)準(zhǔn)試劑：購(gòu)自陜西楊凌賽齊曼生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：NaCl 1.000 g，K2HPO41.500 g，KH2PO40.500 g，MgSO4·7H2O 0.200 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0～7.2，121.3 ℃滅菌 25 min。（按需要量加入多菌靈）

分離純化培養(yǎng)基：NaCl 1.000 g，K2HPO41.500 g，KH2PO40.500 g，MgSO4·7H2O 0.200 g，(NH4)2SO42.000 g，瓊脂 16～20 g，蒸餾水 1000 mL。（按需要量加入多菌靈）

降解試驗(yàn)用培養(yǎng)基：配方同分離純化培養(yǎng)基（不含瓊脂），多菌靈加入所需要的量。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：NaCl 5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，瓊脂 16～20 g，蒸餾水 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 多菌靈降解菌株的分離

在250 mL 裝有100 mL 富集培養(yǎng)基（含多菌靈濃度為50 mg·L-1）的三角瓶中，加入5 g 新鮮土樣，于 30 ℃ ,150 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng) 5 d，吸取5 mL 上清液接入100 mL 多菌靈濃度提高到100 mg·L-1的富集培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)5 d，如此按每次增加100 mg·L-1的多菌靈濃度進(jìn)行富集培養(yǎng)，直至多菌靈濃度增加到600 mg·L-1。取最后一次的富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，取10-8～10-10稀釋度的稀釋液涂布于分離純化培養(yǎng)基平板上（含多菌靈濃度為 200 mg·L-1），于 30 ℃培養(yǎng)4 d 后，用接種針挑取形態(tài)和顏色各異、菌落比較大的菌株，在分離純化培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線分離，30 ℃培養(yǎng)，如此連續(xù)分離5 次得到純種菌株，轉(zhuǎn)入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，保存于 4 ℃冰箱[7]。

1.2.2 多菌靈降解菌株的降解能力測(cè)定和篩選

多菌靈降解率的測(cè)定采用紫外分光光度法[8]。因?yàn)橛脝我坏淖畲笪詹ㄩL(zhǎng)測(cè)定多菌靈含量結(jié)果偏高,本研究引進(jìn) 278、281、290 nm 三波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，按照多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作步驟，測(cè)定不同含量多菌靈的三波長(zhǎng)校正吸光度ΔA=[A281-(A279+A290)/2]，以校正吸光度ΔA 為縱坐標(biāo)，多菌靈的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定降解液校正吸光度，根據(jù)曲線的回歸方程求出降解液多菌靈濃度，計(jì)算降解率。

多菌靈降解菌株的篩選，配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基50 mL 于250 mL 三角瓶中,接種分離菌株,在 30℃、150 r·min－1搖床培養(yǎng) 24 h 制好種子液。按5%的接種量分別接種種子液到裝有250mL、分別含多菌靈 100 mg·L－1和 200 mg·L－1的降解培養(yǎng)基中,以不接菌處理作為對(duì)照，30 ℃,150 r·min－1培養(yǎng)5 d，取降解培養(yǎng)液測(cè)定校正吸光度ΔA，計(jì)算多菌靈殘留濃度和降解率，篩選出多菌靈降解菌。

多菌靈降解率計(jì)算公式為Z=[(A-B)/A]×100%。式中，Z 為降解率（%）；A 為未接菌降解試驗(yàn)用培養(yǎng)基中多菌靈濃度（mg·L－1）；B 為接菌培養(yǎng)后降解試驗(yàn)用培養(yǎng)基（降解液） 中多菌靈濃度（mg·L－1）。

1.2.3 多菌靈降解菌株的形態(tài)及生化鑒定

將分離篩選到的多菌靈高效降解菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其菌落形態(tài)，做菌體涂片進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。生理生化鑒定部分參照文獻(xiàn)[1,9]進(jìn)行。

1.2.4 多菌靈降解菌的生長(zhǎng)特性與耐鹽性

1）菌株生長(zhǎng)曲線

取保藏菌株轉(zhuǎn)接斜面，30℃培養(yǎng)18h 復(fù)壯后，接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基搖菌管中，30℃，150 r·min－1培養(yǎng)16 h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取出放入冰箱作為接種母液。制備100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，按照2%接種量接種，30 ℃，150 r·min－1搖瓶培養(yǎng)，定時(shí)從搖瓶中取樣，測(cè)定600 nm 波長(zhǎng)處的吸光值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線圖。

2）菌株耐鹽濃度范圍

取5 瓶100 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，以5%的接種量接入對(duì)數(shù)期種子液，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基含 NaCl 含量為 1%，2%，3%，4% 和 5%，30 ℃，150 r·min－1培養(yǎng) 28 h，從每瓶中取樣，測(cè)定培養(yǎng)基600 nm 波長(zhǎng)處的吸光值。以鹽濃度為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)的耐鹽濃度范圍圖。

1.2.5 多菌靈降解菌對(duì)多菌靈的降解特性

1）溫度對(duì)多菌靈降解的影響

取5 瓶100 mL 降解試驗(yàn)培養(yǎng)基，多菌靈濃度 200 mg·L－1，調(diào)節(jié) pH 為 6.0，以 5%的接種量接入處于對(duì)數(shù)期種子液，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃下，150 r·min－1搖床培養(yǎng)，72 h 后取樣檢測(cè)多菌靈的降解率。

2）pH 對(duì)多菌靈降解的影響

取5 瓶100 mL 降解試驗(yàn)培養(yǎng)基，多菌靈濃度200 mg·L－1，調(diào)節(jié)初始 pH 分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以5%的接種量接入對(duì)數(shù)期種子液,30 ℃、150 r·min－1條件下培養(yǎng)，72 h 后取樣檢測(cè)多菌靈的降解情況。

3）接種量對(duì)多菌靈降解的影響

取5 瓶100 mL 降解試驗(yàn)培養(yǎng)基，多菌靈濃度 200 mg·L－1，調(diào)節(jié) pH 為 6.0，分別以 1%、3%、5%、7%、9%的接種量接入對(duì)數(shù)期種子液,30 ℃、150 r·min－1條件下培養(yǎng)，72 h 后取樣檢測(cè)分析培養(yǎng)液中的多菌靈濃度。

4）初始濃度對(duì)多菌靈降解的影響

取5 瓶100 mL 降解試驗(yàn)培養(yǎng)基，添加不同量的多菌靈，使其濃度分別為 100、150、200、250、300 mg·L－1，調(diào)節(jié) pH 為 6.0，按 5%的接種量接入對(duì)數(shù)期種子液，30 ℃、150 r·min－1搖床培養(yǎng)，每隔24 h 取樣檢測(cè)篩選的菌株對(duì)多菌靈的降解量。

5）外加碳源和氮源對(duì)多菌靈降解的影響

測(cè)氮源對(duì)多菌靈降解的影響時(shí)，在含多菌靈為 200 mg·L－1的 250 mL 降解試驗(yàn)培養(yǎng)基中添加1%的酵母浸粉； 測(cè)碳源影響時(shí)，在含多菌靈為200 mg·L－1的 250 mL 降解試驗(yàn)培養(yǎng)基中添加 1%的葡萄糖；同時(shí)測(cè)碳氮源的共同影響，另外以同樣量不添加酵母浸粉和葡萄糖的降解試驗(yàn)培養(yǎng)基做對(duì)照（此即多菌靈為唯一碳氮源）[10-12]。按5%接種量接入對(duì)數(shù)期種子液，調(diào)節(jié)pH 為6.0，30 ℃、150 r·min－1搖床培養(yǎng),每間隔 12 h 取樣 1 次，檢測(cè)篩選菌株對(duì)多菌靈的降解量。

1.2.6 多菌靈降解菌株耐受其他農(nóng)藥檢測(cè)

土壤環(huán)境是復(fù)雜的，往往不只有一種農(nóng)藥，活的菌株能否在土壤中定殖決定于其是否能夠耐受土壤復(fù)雜環(huán)境中的多重不利因素，因此進(jìn)一步檢測(cè)多菌靈降解菌株對(duì)氯氰菊酯（中保殺蟲），百菌清（青島奧的斯），吡蟲啉（淄博新農(nóng)基比巧），啶蟲脒（深圳諾普信），腐霉利（江西禾益化工） 及氧化樂果 6 種農(nóng)藥[13]的耐受能力。配制牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，待冷卻至 60 ℃后按農(nóng)藥終濃度 0.2%分別加入各農(nóng)藥，混合均勻后傾制平板。在各個(gè)農(nóng)藥平板上劃線接種多菌靈降解菌株，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌株在平板上的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈降解菌株的分離

經(jīng)逐級(jí)富集培養(yǎng)、觀察菌株在固體分離培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落和透明圈，分離到14 株菌能夠在以多菌靈為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌株編號(hào)分別為 D-1，D-2，D-3，…，D-14。

2.2 多菌靈降解菌株的篩選

按照制作多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，測(cè)定不同含量多菌靈的三波長(zhǎng)校正吸光度△A，△A=［A281-(A278+A290)/2］，以校正吸光度△A 為縱坐標(biāo)，多菌靈的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。在 0～50 μg 濃度范圍內(nèi)，曲線的回歸方程為Y=-0.00024+0.00427X(μg)，Y 為校正吸光度△A，相關(guān)系數(shù) R2=0.9991，說(shuō)明本研究線性關(guān)系良好，靈敏度較高。使用此公式需對(duì)降解液進(jìn)行約2000 倍稀釋才能在檢測(cè)有效范圍內(nèi)，雖然增加了稀釋可能帶來(lái)的誤差，但可快速簡(jiǎn)便的篩選出多菌靈的高效降解菌株。

將分離到的14 株菌接入多菌靈初始濃度為100 mg·L-1的降解培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩,30 ℃,搖150 r·min-1下培養(yǎng) 5 d，測(cè)定降解液的三波長(zhǎng)校正吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算多菌靈濃度和降解率，結(jié)果如表1 所示。從表1 中可以看出，14株菌的降解效果存在顯著差異，D-1、D-4、D-6、D-7、D-9 菌株降解多菌靈的能力較強(qiáng)，降解率分別為69.63%、81.37%、28.35%、45.74%、53.91%。

表1 初篩14 株菌對(duì)多菌靈的降解效果

再將降解多菌靈能力較強(qiáng)的5 株菌D-1、D-4、D-6、D-7、D-9 接種到多菌靈初始濃度為 200 mg·L-1降解培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩,30 ℃，150 r·min-1下培養(yǎng) 5 d，測(cè)降解液的三波長(zhǎng)校正吸光度計(jì)算多菌靈的降解情況，如表2 所示。從表2 可以看出，5 株菌在多菌靈濃度升高后仍具有較強(qiáng)的降解能力，但降解率差異顯著。D-4 菌株降解率達(dá)（71.93±0.56a）%，明顯強(qiáng)于 D-1、D-6、D-7、D-9 菌株的降解效果，D-6菌株對(duì)多菌靈的降解率最低，為（12.08±0.39e）%。對(duì)照表1 初篩測(cè)定結(jié)果還可以看出，5株菌在多菌靈為 200 mg·L-1和 100 mg·L-1的初始濃度下，對(duì)多菌靈降解率高低順序一致。

表2 復(fù)篩5 株菌對(duì)多菌靈的降解效果

2.3 多菌靈降解菌株D-4的形態(tài)及生理生化特征

將分離純化得到的多菌靈高效降解菌株D-4接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，其在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)18～24 h 觀察，菌落呈白色、不透明、圓形、隆起、表面光滑，濕潤(rùn)，邊緣完整。革蘭氏染色結(jié)果呈陽(yáng)性。其生理生化特征見表3。從菌株的生理生化特性看，該菌呈陰性的指標(biāo)較多，尤其是對(duì)有機(jī)碳源利用范圍較窄，基本不利用氨基酸，這有利于它對(duì)多菌靈為唯一碳氮源的利用。另外能利用無(wú)機(jī)鹽和無(wú)機(jī)氮，且能分解產(chǎn)生H2S 等，可能與該菌分解能力強(qiáng)有關(guān)。

表3 菌株D-4 的生理生化特性

2.4 多菌靈降解菌D-4的生長(zhǎng)特性和耐鹽性

如圖 1 和圖 2 所示，D-4 菌株以 2% 接種量接種，30 ℃，150 r·min-1培養(yǎng)，于 16 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，大約在 28 h 進(jìn)入平穩(wěn)期，平穩(wěn)期可一直維持至 48 h。耐鹽性測(cè)試表明，D-4 菌株在NaCl 濃度 1%～3%均可正常生長(zhǎng)。

圖1 D-4 菌株的生長(zhǎng)曲線

圖2 D-4 菌株生長(zhǎng)鹽濃度

2.5 多菌靈降解菌D-4對(duì)多菌靈的降解特性

2.5.1 溫度、 初始pH 對(duì)D-4 菌株降解多菌靈的影響

從圖3 溫度對(duì)D-4 菌株降解多菌靈的影響可以看出，菌株的溫度適應(yīng)范圍較寬，在較低溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高菌株對(duì)多菌靈的降解率一直增加，當(dāng)溫度增加到30 ℃時(shí)降解率達(dá)到最大值68.65%,此后隨著溫度的增加降解率逐漸下降，到 40 ℃時(shí)降低到 29.84%； 圖 4 初始 pH 對(duì)D-4 降解多菌靈的影響結(jié)果表明，在pH 較低時(shí),D-4 對(duì)多菌靈的降解率不高，pH 為4.0 時(shí)，降解率僅為23.71%,隨著pH 增大，降解率增加明顯,pH 為6.0 時(shí)降解效果最好，降解率達(dá)66.38%。但當(dāng)pH 大于6 以后，D-4 對(duì)多菌靈的降解率就急劇下降，這是因?yàn)槎嗑`在接近堿性的條件下溶解度減小容易析出，從而減少了降解菌株與多菌靈接觸的機(jī)會(huì)。

圖3 溫度對(duì)D-4 菌株降解多菌靈的影響

圖4 pH 對(duì)D-4 菌株降解多菌靈的影響

2.5.2 接種量對(duì)D-4 菌株降解多菌靈的影響

如圖5,在1%～5%的接種量范圍內(nèi)，D-4菌株對(duì)多菌靈的降解率隨接種量的增加而增大,當(dāng)接種量為5%時(shí),其降解率達(dá)到65.82%。當(dāng)接種量超過5%以后,菌株D-4 對(duì)多菌靈的降解率趨于穩(wěn)定，隨后漸漸降低?？紤]到實(shí)際應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)效益，選5%的接種量降解效果最佳。

圖5 D-4 菌株接種量對(duì)多菌靈降解的影響

2.5.3 初始濃度對(duì)D-4 菌株降解多菌靈的影響

圖6 表明，菌株D-4 對(duì)不同濃度多菌靈都具有一定的降解效果，且濃度不同，降解效果差異較大。在多菌靈起始濃度較低時(shí)，D-4 菌株對(duì)多菌靈的降解迅速。當(dāng)多菌靈濃度為100 mg·L－1和 150 mg·L－1時(shí)，測(cè)得多菌靈濃度幾乎接近直線下降，120 h 后多菌靈濃度分別降至 10.63 mg·L－1和 20.57 mg·L－1，降解率分別為 89.37%和86.29%。當(dāng)起始多菌靈濃度較高時(shí)，開始一段時(shí)間內(nèi)，多菌靈降解較慢，特別是多菌靈濃度為300 mg·L－1時(shí),開始70 h 內(nèi)多菌靈降解很少，隨后降解開始明顯增加。可見隨著多菌靈濃度的增大，菌株D-4對(duì)多菌靈的降解受到抑制或者需要較長(zhǎng)一段的適應(yīng)期。120 h 后，200、250、300 mg·L－1的多菌靈分別降至 35.64、94.31、140.57 mg·L－1,降解率分別為82.18%、62.28%和53.14%。

圖6 初始多菌靈濃度對(duì)菌株降解多菌靈的影響

2.5.4 外加碳源、氮源對(duì)D-4 菌降解多菌靈的影響

如圖7，在以多菌靈為唯一碳氮源的對(duì)照培養(yǎng)中，84 h 后多菌靈濃度從 200 mg·L－1降至55.83 mg·L－1，降解率為 72.09%。而以多菌靈為唯一氮源，補(bǔ)加葡萄糖作碳源、以多菌靈為唯一碳源，補(bǔ)加酵母浸粉為氮源和在同時(shí)添加葡萄糖和酵母浸粉的情況下，多菌靈濃度由200 mg·L－1分別降至 32.65、26.34、19.17 mg·L－1，降解率分別為83.68%、86.83%和90.42%，較對(duì)照分別提高了11.59%、15.26%和18.33%。由此可見，葡萄糖和酵母浸粉對(duì)多菌靈的降解有顯著的促進(jìn)作用。

圖7 碳源和氮源對(duì)菌株降解多菌靈的影響

2.6 多菌靈降解菌株D-4對(duì)其他農(nóng)藥的耐受性

考慮到土壤環(huán)境的復(fù)雜性，它往往不只有一種農(nóng)藥，活的菌株能否在土壤中定殖決定于其是能夠耐受土壤復(fù)雜環(huán)境中的多重不利因素，因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了多菌靈降解菌株對(duì)氯氰菊酯（中保殺蟲），百菌清（青島奧的斯），吡蟲啉（淄博新農(nóng)基比巧），啶蟲脒（深圳諾普信），腐霉利（江西禾益化工）及氧化樂果 6 種農(nóng)藥的耐受能力。結(jié)果表明，多菌靈降解菌株D-4 還可以分別在濃度為 0.2%的百菌清、氯氰菊酯、啶蟲脒、腐霉利、吡蟲啉及氧化樂果 6 種農(nóng)藥平板上生長(zhǎng)，對(duì)這些農(nóng)藥具有一定耐受性。土壤環(huán)境是復(fù)雜的，可能有多重不利因素，尤其是長(zhǎng)期連作棚室土壤，往往不只使用一種農(nóng)藥。所以該菌株的多重適應(yīng)性是其實(shí)際應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。

3 結(jié)論和討論

本研究從商州區(qū)劉灣長(zhǎng)期使用多菌靈的連作蔬菜基地土壤中分離到14 株能以多菌靈作為唯一碳氮源生長(zhǎng)的多菌靈降解菌株，篩選出的菌株D-4 對(duì)多菌靈具有高效降解能力，在含多菌靈100mg·L－1和200mg·L－1的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5 d，對(duì)多菌靈降解率分別可達(dá)到81.37%和71.9 3%。該菌株生長(zhǎng)和降解多菌靈的鹽濃度、pH 和溫度范圍比較寬泛，最適條件為 pH 值 6.0，溫度 30 ℃，接種量5%。初始多菌靈濃度越高，開始時(shí)菌株D-4對(duì)多菌靈降解率越低，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，降解率逐步升高。添加少量葡萄糖、酵母浸提液作額外碳氮源時(shí)可促進(jìn)菌株 D-4 對(duì)多菌靈的降解，與不添加額外碳氮源相比降解率提高了18.33%。研究還發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)農(nóng)業(yè)上常用的其他6 種農(nóng)藥氯氰菊酯，百菌清，吡蟲啉，啶蟲脒，腐霉利及氧化樂果也具有耐受性。研究結(jié)果表明菌株D-4 在農(nóng)藥污染土壤修復(fù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

根據(jù)同類研究報(bào)道，采用的農(nóng)藥初始濃度和培養(yǎng)時(shí)間不同，篩選出的降解菌對(duì)多菌靈的降解效率差異較大，大部分降解菌對(duì)低濃度多菌靈都具有較好的降解效果，但在高濃度條件下，降解率則顯著降低[13-15]。本研究也發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象，初始多菌靈濃度越高，開始時(shí)菌株D-4 對(duì)多菌靈降解率越低，但不同的是，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，菌株D-4對(duì)多菌靈的降解率就會(huì)逐步升高。這一現(xiàn)象說(shuō)明，在高濃度的多菌靈條件下，菌株有一段相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)期，經(jīng)過這一段時(shí)期后，細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)出了更多的降解酶，因此降解率也能達(dá)到較高水平，這說(shuō)明降解菌D-4 降解多菌靈的能力是可以馴化提高的，這也是本研究中采取逐級(jí)富集馴化培養(yǎng)來(lái)分離篩選多菌靈降解菌的根據(jù)。該現(xiàn)象對(duì)實(shí)際污染土壤的修復(fù)也有重要啟示：即應(yīng)在土壤中多菌靈殘留不多的情況下就接種降解菌進(jìn)行修復(fù)，因?yàn)槎嗑`殘留濃度越高，就需要更長(zhǎng)時(shí)間才能降解。

與初始多菌靈濃度相聯(lián)系，菌株的接種量也要達(dá)到一定量的要求，才能提高多菌靈的降解率[16-17]。本研究中，當(dāng)多菌靈含量為200 mg·L-1時(shí)，菌種接種量為 5%，pH 值為 6.0，30 ℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h，降解率比其他接種量都高，達(dá)到65.82%。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，存在著水肥營(yíng)養(yǎng)因素、其他微生物的相互影響和其他各種類型的農(nóng)藥殘留，其土壤 pH、 溫度及土壤鹽分也發(fā)生著周期性變化。因此在多菌靈降解菌的篩選和研究開發(fā)中，需要進(jìn)一步研究功能菌對(duì)其他各種微生物和其他類型農(nóng)藥的耐受性[18]。從報(bào)道看，部分研究篩選的菌株對(duì)發(fā)揮生物學(xué)作用的條件要求也較為苛刻，所以需要篩選能滿足大田粗放條件下的高效降解菌株。

目前已發(fā)現(xiàn)具有降解多菌靈能力的微生物涵蓋了細(xì)菌、真菌及放線菌，其中以變形菌綱微生物居多[19-20]。本研究對(duì)篩選到的降解菌將進(jìn)一步用16S rDNA 序列分析鑒定，以確定其種屬和發(fā)育地位，進(jìn)一步進(jìn)行理論研究，同時(shí)開展應(yīng)用研究，將篩選到的高效降解菌株應(yīng)用到污染土壤的修復(fù)中。