二維相關(guān)光譜在大米中甲基毒死蜱特征變量?jī)?yōu)選的應(yīng)用

胡 瀟，黃俊仕，朱曉宇，劉 鵬，吳瑞梅，邱 霞，艾施榮,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，江西 南昌 330045；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045)

大米是中國(guó)的主要食糧，其品質(zhì)安全關(guān)系到國(guó)民健康，但部分農(nóng)戶為了追求經(jīng)濟(jì)利益，在水稻種植和貯藏過(guò)程中濫用農(nóng)藥，造成大米中存在嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留問(wèn)題。甲基毒死蜱(Chlorpyrifos-methyl)是一種高效廣譜的有機(jī)磷農(nóng)藥，常用于水稻種植中防治病蟲害[1]，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定大米中甲基毒死蜱最大殘留量低于5 mg/kg。目前，用于大米中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的主要方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[2-5]，但這些方法存在前處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本昂貴等缺陷。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)因具有前處理簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于食品農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)[6-9]。Luo等[10]利用SERS技術(shù)快速檢測(cè)蘋果汁中百草枯殘留，分別建立840、1 189、1 294、1 645 cm-14個(gè)特征峰標(biāo)準(zhǔn)分析曲線，其最低檢測(cè)濃度可達(dá)0.02 μg/mL。目前，有學(xué)者采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法優(yōu)選多個(gè)農(nóng)藥拉曼特征譜峰，建立了食品農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的預(yù)測(cè)模型，以提高模型的精度和冗余性。翁士壯等[11]采用主成分分析對(duì)蘋果表面的敵瘟磷拉曼光譜進(jìn)行特征提取，當(dāng)主成分為4時(shí)，建立支持向量機(jī)(SVM)回歸模型，模型交互均方根誤差最低為0.065 7 mg/L，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)敵瘟磷溶液(100～0.1 mg/L)的濃度。李曉麗等[12]采用融合反向間隔偏最小二乘、競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)算法和連續(xù)投影算法對(duì)龍井茶中美術(shù)綠的拉曼光譜特征波段進(jìn)行深入挖掘，優(yōu)選出14個(gè)特征波數(shù)，建立最小二乘支持向量機(jī)定量分析模型，模型預(yù)測(cè)集的決定系數(shù)達(dá)到0.94，均方根誤差為0.535。也有研究采用二維相關(guān)光譜(Two-dimensional correlation spectroscopy，2DCOS)將拉曼光譜中的一些重疊峰和弱峰凸顯出來(lái)，以提高光譜分辨率。該方法將常規(guī)光譜信號(hào)擴(kuò)展到二維，根據(jù)研究目的選擇特定的外擾因素，誘發(fā)光譜信號(hào)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，解析其二維同步光譜圖和自相關(guān)譜圖，觀察光譜對(duì)外擾的變化情況，研究了各組分基團(tuán)分子振動(dòng)行為的差異，以尋找出與外擾密切相關(guān)的特征譜峰[13-14]。

本文利用SERS技術(shù)結(jié)合二維相關(guān)光譜方法快速分析大米中甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留。采用2DCOS方法提取大米中甲基毒死蜱SERS譜圖的特征信息，以甲基毒死蜱濃度為外擾，進(jìn)行二維相關(guān)同步光譜和自相關(guān)譜解析，篩選出與甲基毒死蜱濃度變化密切相關(guān)的特征譜峰，建立了大米中甲基毒死蜱殘留的SVM定量分析模型，從而為大米中農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)裝置的研發(fā)提供了方法支持。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

便攜式拉曼光譜儀(RamTracer-200-HS，美國(guó)歐普?qǐng)D斯光學(xué)納米科技有限公司)，低速離心機(jī)(JW-1024 ，安徽嘉文儀器裝備有限公司)，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Agilent GC 7000，美國(guó)安捷倫科技有限公司)，N-丙基乙二胺(PSA，天津博納艾杰爾科技有限公司)，C18(北京迪馬科技有限公司)，甲基毒死蜱(98.5%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)，濾膜(13 mm、0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，乙腈(分析純)、氯化鈉(99.5%)、無(wú)水硫酸鎂(98.0%)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，陰性大米樣本由江西省出入境檢驗(yàn)檢疫局提供，金納米溶膠于實(shí)驗(yàn)室自制；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 甲基毒死蜱農(nóng)殘樣本的制備

1.2.1 甲基毒死蜱溶液的制備準(zhǔn)確稱取10 mg甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L的甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.2 模擬甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留樣本的制備取82份陰性大米樣本，每份10 g，編號(hào)1～82，曬干。用乙腈將質(zhì)量濃度為100 mg/L甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成82個(gè)不同濃度梯度，范圍為0.1～76 mg/L，每份10 mL，將82個(gè)不同濃度的甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液均勻噴灑至對(duì)應(yīng)編號(hào)大米樣本，放置干燥陰涼處晾干后，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，備用。

1.2.3 含農(nóng)殘大米樣本前處理提?。悍Q取5 g含農(nóng)藥殘留大米粉末于50 mL離心管中，依次加入10 mL水、10 mL乙腈、5 g氯化鈉，振蕩渦旋2 min后，4 200 r/min離心5 min。

凈化：稱取300 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18于10 mL離心管中，取2 mL上清液加至上述離心管中，渦旋1 min后，4 200 r/min離心5 min，提取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，用于拉曼光譜的檢測(cè)。

1.3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件

色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至200 ℃，保持0 min；以16 ℃/min升至280 ℃，保持7 min后運(yùn)行；載氣：氦氣；載氣流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源：EI源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；碰撞氣：氮?dú)猓徊杉Ｊ剑哼x擇離子掃描(SRM)。以上實(shí)驗(yàn)條件用于測(cè)定樣本的實(shí)際濃度。

1.4 甲基毒死蜱分子理論模擬

采用Gaussview軟件構(gòu)建甲基毒死蜱分子結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Gauss03對(duì)其進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算方法為B3LYP，基組設(shè)置為6～31G，由Gaussview打開計(jì)算結(jié)果，得到甲基毒死蜱分子理論上的拉曼光譜。

1.5 表面增強(qiáng)拉曼光譜采集

取500 μL金膠、40 μL甲基毒死蜱溶液和100 μL 1%的氯化鈉溶液加至2 mL石英進(jìn)樣瓶，混合均勻后，上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣本測(cè)量3次，取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)大米樣本的二維同步譜圖和自相關(guān)譜圖優(yōu)選出與甲基毒死蜱殘留濃度密切相關(guān)的特征譜峰，建立了大米中甲基毒死蜱殘留的SVM分析模型。采用SNV預(yù)處理原始光譜后，以甲基毒死蜱濃度為外擾變量進(jìn)行二維相關(guān)光譜(2DCOS)分析，得到同步二維相關(guān)譜圖和自相關(guān)譜圖。同步二維相關(guān)譜圖關(guān)于主對(duì)角線(Diagnosis line)對(duì)稱，處于主對(duì)角線上的譜峰為自相關(guān)峰(Auto-peak)。自相關(guān)峰表示化學(xué)基團(tuán)對(duì)甲基毒死蜱濃度微擾的敏感程度，以同步二維相關(guān)譜圖中的等高線反映其自相關(guān)峰的強(qiáng)弱，即自相關(guān)譜圖的峰強(qiáng)度越高，表明該譜峰對(duì)甲基毒死蜱濃度越敏感。結(jié)合等高線密集中心點(diǎn)位置和自相關(guān)譜峰強(qiáng)度即可確定與甲基毒死蜱濃度密切相關(guān)的特征峰[13,15]。

以訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)(RC)、訓(xùn)練集均方根誤差(Root mean square error of calibration，RMSEC)、預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)(RP)、預(yù)測(cè)集均方根誤差(RMSEP)和相對(duì)分析誤差(RPD)評(píng)價(jià)模型性能和精度。當(dāng)RPD大于3.0時(shí)，說(shuō)明模型性能可靠，預(yù)測(cè)精度好，可用于實(shí)際樣品的估測(cè)[16]。

圖1 甲基毒死蜱的理論光譜(a)、5 mg/L甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液(b)及乙腈(c)的SERSFig.1 Theoretical Raman spectrum of chlorpyrifos-methyl(a)，SERS of 5 mg/L chlorpyrifos-methyl standard solution(b) and acetonitrile(c)

2 結(jié)果與討論

2.1 甲基毒死蜱農(nóng)藥分子理論計(jì)算光譜與實(shí)驗(yàn)光譜分析

圖1分別為甲基毒死蜱的理論計(jì)算光譜(曲線a)，5 mg/L甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液(曲線b)及乙腈(曲線c)的表面增強(qiáng)拉曼光譜。從圖中可看出，在454、610、672和1 180 cm-1處，實(shí)驗(yàn)譜峰與理論計(jì)算譜峰完全一致，在582、988、1 268、1 320 cm-1處實(shí)驗(yàn)譜峰與理論計(jì)算譜峰相比略有偏移，而在1 082 cm-1處觀察到的理論譜峰并未在實(shí)驗(yàn)光譜中出現(xiàn)。這是因?yàn)槔碚撃M譜峰是在理想狀態(tài)下對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行模擬仿真計(jì)算，并未考慮分子間作用力的影響，而實(shí)驗(yàn)譜峰中則在甲基毒死蜱與溶劑分子間存在相互作用力，從而導(dǎo)致部分實(shí)驗(yàn)譜峰與理論計(jì)算譜峰略有偏移，以及部分譜峰在理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)中未同時(shí)出現(xiàn)等現(xiàn)象[17]。

圖2 20 mg/L甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)、大米提取液中10.09 mg/kg甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留(b)、陰性大米樣本(c)及乙腈(d)的SERSFig.2 SERS of 20 mg/L chlorpyrifos-methyl standard solution(a),10.09 mg/kg chlorpyrifos-methyl from rice extraction(b),negative matrix of rice extraction(c) and acetonitrile(d)

2.2 大米中甲基毒死蜱殘留的分析

圖2分別為20 mg/L甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液(曲線a)、大米提取液中10.09 mg/kg甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留(曲線b)、陰性大米樣本(曲線c)及乙腈(曲線d)的SERS?；凇?.1”可知，圖2b在454、582、610、672、1 268 cm-1處出現(xiàn)了甲基毒死蜱分子的特征譜峰。經(jīng)解譜可知，990 cm-1歸屬于CH3—O—P上P—O—C的伸縮振動(dòng)，與上文988 cm-1歸屬相同，也屬于甲基毒死蜱的特征峰，對(duì)比圖2c和圖2d，這些特征譜峰并未與大米和乙腈的拉曼譜峰重疊，由此可選擇這些特征峰用于大米中甲基毒死蜱的定性定量分析。

2.3 基于二維相關(guān)光譜特征變量?jī)?yōu)選

圖3A為82個(gè)大米樣本的原始拉曼光譜，可觀察到圖中存在基線漂移等噪音干擾，采用SNV對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后的光譜如圖3B。

采用2DCOS方法從大米的拉曼光譜中優(yōu)選出多個(gè)農(nóng)藥特征譜峰，圖4為其同步二維相關(guān)譜圖(圖4A)及自相關(guān)譜圖(圖4B)。由圖4A可知，在400～1 400 cm-1波長(zhǎng)范圍中，較強(qiáng)自相關(guān)峰為主對(duì)角線上等高線密集中心點(diǎn)位置處，即610、672、988、1 268 cm-1波長(zhǎng)處；由圖4B知，上述波長(zhǎng)處對(duì)應(yīng)位置均為波峰。綜上，采用2DCOS方法優(yōu)選出的4個(gè)特征譜峰為610、672、988、1 268 cm-1，該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果(見(jiàn)“2.2”)完全相同，且與Shende等[18]的研究結(jié)果相吻合，說(shuō)明采用2DCOS方法優(yōu)選的610、672、988、1 268 cm-1特征峰是甲基毒死蜱分子的特征譜峰。

圖3 原始光譜(A)及SNV預(yù)處理后的光譜(B)Fig.3 Original spectra(A) and spectra after SNV pre-treatment(B)

圖4 大米中甲基毒死蜱的二維相關(guān)光譜(A)與自相關(guān)譜(B)Fig.4 Two-dimensional correlation synchronization spectrum(A) and diagnosis spectrum(B) of chlorpyrifos-methyl residue in rice sample

圖5 CARS提取特征波數(shù)過(guò)程圖Fig.5 CARS extraction characteristic variables processA：trend of wavelength number,B:trend of RMSECV,C:trend of wavelength variable regression coefficient

圖6 SVM模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的散點(diǎn)圖Fig.6 Scatter plots of predicted and measured values of SVM modelA:calibration set;B.prediction set

2.4 SVM模型建立與性能比較

從82個(gè)樣本中選出55個(gè)組成校正集用于建立模型，剩余27個(gè)作為預(yù)測(cè)集用于測(cè)試模型性能?；?DCOS優(yōu)選的4個(gè)特征譜峰，建立了大米中甲基毒死蜱殘留濃度的SVM模型，模型建立過(guò)程中，采用網(wǎng)格搜索和五折交叉驗(yàn)證法對(duì)懲罰系數(shù)c和核函數(shù)g進(jìn)行優(yōu)化，確定c和g分別為44.68和8.36。圖6為建立的大米中甲基毒死蜱殘留SVM模型校正集和預(yù)測(cè)集的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值散點(diǎn)圖，模型對(duì)校正集RC為0.98，RMSEC為3.94，y=0.945 2x+1.467 6;對(duì)預(yù)測(cè)集RP為0.96，RMSEP為5.21，RPD為3.66，其值大于3，y=0.979 7x+0.519 0。說(shuō)明模型可用于大米中甲基毒死蜱殘留的實(shí)際估測(cè)。

表2為基于全光譜、CARS優(yōu)選的11個(gè)特征變量及基于2DCOS優(yōu)選的4個(gè)特征變量所建偏最小二乘回歸(Partial least squares,PLS)和SVM模型。由表可知，基于2DCOS優(yōu)選的特征變量所建模型的預(yù)測(cè)能力優(yōu)于基于CARS和全光譜所建的模型，而基于CARS的則優(yōu)于基于全光譜的，這是因?yàn)橛?DCOS篩選的甲基毒死蜱的特征峰參與了建模，提高了模型精度和預(yù)測(cè)能力，而全光譜區(qū)包含了大量與甲基毒死蜱分子無(wú)關(guān)和冗余的信息，CARS也優(yōu)選了少數(shù)與甲基毒死蜱分子無(wú)關(guān)的信息參與建模，從而影響了模型的精度和穩(wěn)定性。此外，2DCOS方法僅優(yōu)選4個(gè)特征峰建模就能達(dá)到最優(yōu)預(yù)測(cè)效果，占全光譜變量的0.8%，模型得到簡(jiǎn)化。由表2還可知，所建SVM模型性能優(yōu)于PLS模型，其RPD值均高于3，可用于實(shí)際估測(cè)，說(shuō)明大米中甲基毒死蜱的拉曼光譜變量與甲基毒死蜱農(nóng)藥的濃度之間傾向于非線性關(guān)系。

表2 模型結(jié)果的比較Table 2 Comparison between the results of different models

*principal component numbers(主成分?jǐn)?shù))

表3 大米中甲基毒死蜱農(nóng)藥的SVM模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的比較Table 3 Comparison between predicted values and measured values of chlorpyrifos-methyl residue in rice based on SVM

2.5 模型準(zhǔn)確性與可靠性評(píng)價(jià)

為驗(yàn)證SVM模型的準(zhǔn)確性，對(duì)5個(gè)未知濃度大米樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算其回收率和相對(duì)誤差，結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，5個(gè)大米樣本的預(yù)測(cè)回收率為96.2%～102%，且預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相對(duì)誤差的絕對(duì)值為0.07%～3.8%，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值基本一致，表明所建模型可用于大米中甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。對(duì)這5個(gè)大米樣本的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值做配對(duì)t檢驗(yàn)，t=2.082，其絕對(duì)值小于t0.05,4=2.776(95%顯著性水平)，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間無(wú)顯著差異，表明所建模型應(yīng)用于大米中甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留的實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

本文基于2DCOS方法，以甲基毒死蜱濃度為外擾，對(duì)預(yù)處理后大米樣本的拉曼光譜進(jìn)行了二維相關(guān)同步光譜和自相關(guān)譜解析，篩選出4個(gè)與甲基毒死蜱濃度變化相關(guān)的特征譜峰(610、672、988、1 268 cm-1)，這些特征譜峰與實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果完全吻合。與CARS特征優(yōu)選相比，2DCOS方法更能提高光譜分辨率，且能優(yōu)選出與大米中甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留密切相關(guān)的特征譜峰。表明SERS結(jié)合2DCOS技術(shù)可對(duì)甲基毒死蜱的特征波長(zhǎng)進(jìn)行有效篩選，從而簡(jiǎn)化模型，也為拉曼光譜分析中篩選特征變量提供了新的思路和方法。利用2DCOS優(yōu)選的特征變量建立SVM和PLS模型，得出SVM非線性模型性能優(yōu)于線性PLS模型，且SVM模型可用于大米中甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。