分離式陰極光電化學(xué)檢測致病菌的新方法研究

楊高霞，董玉明，王光麗

(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

致病菌的檢測對于食品安全、環(huán)境保護(hù)和公共安全至關(guān)重要。在100多種已知的大腸桿菌中，大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)是一種可引起多種食源性疾病爆發(fā)的病原體，其感染劑量低至10個(gè)活細(xì)胞[1]。因此，E.coliO157∶H7的高靈敏度、快速檢測備受關(guān)注。傳統(tǒng)檢測E.coliO157∶H7的方法是培養(yǎng)法[2]，但這種方法耗時(shí)耗力，不能滿足快速檢測的要求。非培養(yǎng)方法，如核酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)具有快速、高靈敏和特異性的優(yōu)勢[3]，但該方法需要昂貴的設(shè)備和熟練的技術(shù)人員，從而限制了其廣泛應(yīng)用。為了研制出更好方法，最近研究主要集中在電化學(xué)[4-7]、熒光[8]等方法的開發(fā)；但電化學(xué)分析法由于信號的激發(fā)及產(chǎn)生均采用同一種能量形式——電能，因而具有較高的背景信號[9]，且在檢測致病菌時(shí)，往往需要把生物分子固定在電極上[4-7]，導(dǎo)致靈敏度降低，限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用。新興的光電化學(xué)(PEC)分析因?yàn)榫哂醒b置價(jià)廉、操作簡單并且易于微型化等優(yōu)點(diǎn)而在多個(gè)領(lǐng)域得到了應(yīng)用[10]，然而新型的PEC分析方法在致病菌檢測中的應(yīng)用未受到關(guān)注。

PEC分析法是指基于物質(zhì)的光電轉(zhuǎn)換特性而確定待測物濃度的一類分析方法，由于激發(fā)源(光)和檢測信號(電)是兩種完全不同的能量形式，因此該方法比傳統(tǒng)的電化學(xué)法具有更低的背景信號、更高的靈敏度，與光學(xué)檢測方法相比，PEC分析法所用的儀器更便宜且易于微型化[11]，因此在DNA分析、免疫測定、酶生物傳感等領(lǐng)域已被廣泛研究與應(yīng)用[10]。在PEC分析中，相對于研究廣泛的以n型半導(dǎo)體構(gòu)成的光電陽極為換能器的陽極PEC[12]，以p型半導(dǎo)體為光電極的陰極PEC不僅能使電極更加穩(wěn)定而且對生物實(shí)際樣品中共存的還原性物質(zhì)的抗干擾能力更強(qiáng)[13]，在生物分析中具有誘人的應(yīng)用前景?；诖?，本文提出了一種通過形成量子阱(QW)結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)陰極光電流的新策略，并將其成功應(yīng)用于致病菌E.coliO157∶H7的分離式陰極PEC檢測。這種分離式陰極PEC檢測將生物反應(yīng)放至微孔板中進(jìn)行，所產(chǎn)生的信號物質(zhì)Zn2+與PbSe QDs表面的Pb2+發(fā)生離子交換反應(yīng)后，形成ZnSe/PbSe/ZnSe QW結(jié)構(gòu)，使ITO/PbSe電極的陰極光電流得到極大提高。由于生物分子未固定在電極表面，因此避免了常規(guī)PEC分析中，電極表面固定的生物分子由于空間位阻效應(yīng)阻礙信號分子(通常是溶液中的電子受體/供體)擴(kuò)散至電極表面產(chǎn)生信號。該方法成功開拓了陰極光電化學(xué)在致病菌檢測中的應(yīng)用，有望為開發(fā)其它新型高效的PEC檢測方法提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

硝酸鉛、硒粉(Se)、硼氫化鈉、巰基乙酸(TGA)、氫氧化鈉、硝酸鋅(Zn(NO3)2)、硫化鈉、甲醇、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，由4.4 mmol/L Na2HPO4、1.4 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl和137 mmol/L NaCl組成，pH 7.4，25 ℃)；牛血清白蛋白(BSA)；聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的水溶液，平均分子量為200 000～350 000)購自美國 Sigma-Aldrich 公司；(3-巰基丙基)三乙氧基硅烷(MTPES)、4-馬來酰亞胺丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(GMBS)購自上海麥克林生化科技有限公司；大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7，ATCC 35150)購自美國菌種保藏中心(ATCC)。大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、沙門氏菌(Salmonella)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、李斯特菌(Listeria)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)獲自江南大學(xué)生物工程學(xué)院?？咕腗againin I的序列是GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS(23 mer)；Magainin I-C是在Magainin I的C末端用半胱氨酸修飾的抗菌肽，其序列是GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKSC(24 mer)，上述兩種抗菌肽由南京肽業(yè)生物科技有限公司合成并純化。

用實(shí)驗(yàn)室自組裝的PEC檢測系統(tǒng)進(jìn)行光電化學(xué)(PEC)測量，激發(fā)光為500 W 的氙燈(配備紫外線截止濾光片，λ≥400 nm)，CHI 800C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)獲得光電流。檢測光電流的三電極系統(tǒng)：PbSe QDs修飾的ITO玻璃電極(深圳南玻顯示器件有限公司)為工作電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，Pt電極作為對電極；所有PEC測試均在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)中進(jìn)行，電極上的施加電位為-0.05 V(相對于飽和Ag/AgCl)。

1.2 水溶性PbSe QDs的合成及ITO/PbSe電極的制備

巰基乙酸(TGA)修飾的PbSe QDs的制備參照文獻(xiàn)[14]稍作修改：在N2氣氛下利用超聲將3.0 mg Se粉和7.6 mg NaBH4溶解于2.0 mL超純水中以制備新鮮的NaHSe。將25 mL 4.0 mmol/L Pb(NO3)2水溶液與12 μL TGA在圓底三頸燒瓶中混合后，通過1.0 mol/L NaOH溶液將混合液調(diào)至約pH 9.0。N2鼓泡0.5 h以除去反應(yīng)溶液中溶解的O2后，緩慢注入2.0 mL新制備的NaHSe溶液，反應(yīng)溶液的顏色由無色逐漸變?yōu)樯钭厣?。在N2氣氛下將反應(yīng)混合物再攪拌4 h后，將所制備的PbSe QDs在4 ℃下避光保存。

基于帶正電的PDDA和帶負(fù)電的TGA修飾的PbSe QDs間的靜電作用，使用自組裝方法在ITO玻璃上修飾PbSe QDs。ITO通過在2.0 mol/L KOH溶液(溶解在異丙醇中)中煮沸20 min后，用水徹底洗滌并在120 ℃下干燥2 h來清潔。將潔凈的ITO玻璃依次浸入含有0.5 mol/L NaCl和2%PDDA的水溶液、PbSe QDs溶液中各10 min來制備ITO/PbSe電極，每個(gè)浸泡步驟后用超純水洗滌電極。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)以及其他致病菌株如大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、沙門氏菌(Salmonella)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的培養(yǎng)均使用Luria -Bertani(LB)培養(yǎng)基，即含10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物的混合物；李斯特菌(Listeria)的培養(yǎng)基為10 g/L胰蛋白胨、3 g/L牛肉提取物和5 g/L NaCl的混合物。所有菌株均在37 ℃下的營養(yǎng)培養(yǎng)基中振蕩(125 r/min)孵育,培養(yǎng)完畢，通過離心(6 000 r/min，20 min)分離所有細(xì)菌細(xì)胞后，用0.01 mol/L過濾后的pH 7.4 PBS緩沖液(由4.4 mmol/L Na2HPO4、1.4 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl和137 mmol / L NaCl組成, 25 ℃)離心洗滌3次，并重新懸浮于0.01 mol/L過濾后的PBS中以除去殘留的培養(yǎng)基。

使用平板計(jì)數(shù)法測定細(xì)菌細(xì)胞懸浮液的濃度，隨后將等分試樣的細(xì)菌細(xì)胞懸浮液用過濾后的PBS稀釋至所需濃度，再將細(xì)菌細(xì)胞懸浮液在沸水浴中加熱滅活15 min，最后儲存在冰箱中備用。

1.4 實(shí)體樣的檢測

從當(dāng)?shù)亟紖^(qū)獲取的生菜和菠菜(確定施過糞肥)作為待測樣品；按照文獻(xiàn)處理樣品[15]：稱取25 g樣品，研磨30 min后，加入225 mL 0.01 mol/L滅菌的PBS緩沖液攪拌10 min，混合均勻后，過濾混合物，收集濾液。取適量的該濾液直接用本文開發(fā)的分離式PEC法進(jìn)行檢測，以國家標(biāo)準(zhǔn)方法即平板計(jì)數(shù)法[16]作為參照。

1.5 TGA-ZnS QDs的合成及TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復(fù)合物的制備

為了實(shí)現(xiàn)檢測，以制備TGA修飾的ZnS QDs(TGA-ZnS QDs)和Magainin I-C的生物復(fù)合物(即TGA-ZnS QDs/Magainin I-C)作為信號標(biāo)記物。首先，按照文獻(xiàn)[17]稍作修改后合成水溶性TGA-ZnS QDs，即將50 mL 0.02 mol/L Zn(NO3)2水溶液與250 μL TGA在圓底三頸燒瓶中混合。通過加入1 mol/L NaOH將溶液的pH值調(diào)至7.5，使混合液變澄清透明；將該溶液通入氮?dú)?.5 h后加入2 mL 0.25 mol/L Na2S，并將溶液在100 ℃下加熱4 h，反應(yīng)結(jié)束后用異丙醇沉淀，離心，用水溶解洗滌，如此反復(fù)3次以除去未反應(yīng)的試劑，烘干。稱取40 mg TGA-ZnS QDs溶解于1 mL水中(40 mg/mL)，利用EDC和NHS(ZnS∶EDC∶NHS = 1∶1.5∶1.5的摩爾比)在室溫下與TGA-ZnS QDs混合4 h以活化表面羧基，然后離心洗滌除掉過量的EDC和NHS。將88.2 μg Magainin I-C加至活化后的TGA-ZnS QDs溶液中，室溫下攪拌12 h，離心洗滌。最后，將TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復(fù)合物再分散于6 mL 10 mmol/L PBS緩沖溶液(pH 7.4)中以供使用。

1.6 分離式PEC檢測E.coli O157∶H7

在硅烷化96微孔板之前先用甲醇沖洗96微孔板，然后通過GMBS將Magainin I固定在96微孔板上[18]。具體步驟為：用100 μL的2%硅烷(MPTES)溶液覆蓋微孔(將MPTES溶解在用1.0 mol/L乙酸調(diào)至pH 4.0的甲醇中)并溫育30 min，隨后去除溶液并用甲醇洗滌，氮?dú)飧稍?；然后?00 μL 1.0 mmol/L GMBS的無水乙醇溶液加入微孔板，孵育30 min后去掉溶液并洗滌；隨后向孔中加入100 μL 250 μg/mL Magainin I溶液(以10 mmol/L的PBS緩沖溶液作為溶劑)，在室溫下振蕩孵育2 h；然后加入100 μL的1%BSA封閉液封閉30 min，洗滌；再加入100 μL不同濃度的E.coliO157∶H7并在室溫下孵育30 min，洗滌；隨后加入TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復(fù)合物，孵育30 min，洗滌。加入60 μL 0.1 mol/L HNO3溶解TGA-ZnS QDs后，再加入60 μL 0.1 mol/L NaOH將溶液調(diào)至pH 7.0。最后，將ITO/PbSe電極浸入含有上述溶液的96微孔板中15 min。取出電極，用0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)洗滌，并在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)中進(jìn)行PEC測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 PbSe QDs的表征

采用X射線衍射法(XRD)以及透射電鏡法(TEM)對合成的PbSe QDs的組成和形貌進(jìn)行表征。PbSe QDs的XRD圖譜在25.15°、29.12°、41.65°、49.28°、51.63°、60.37°、68.41°、76.02°處出現(xiàn)尖銳的衍射峰(圖1A)，對應(yīng)晶面分別為(111)、(200)、(220)、(311)、(222)、(400)、(420)和(422)，與巖鹽晶體結(jié)構(gòu)的PbSe(JCPDS 06-0354)一致。TEM圖表明所合成的PbSe QDs為球形粒子，直徑約為3.0 nm(圖1B)。

2.2 Zn2+增大ITO/PbSe電極陰極光電流的機(jī)理

ITO/PbSe電極在可見光照射下顯示出陰極光電流，在重復(fù)光激發(fā)循環(huán)照射下，光電流無明顯降低，表明該電極具有良好的光照穩(wěn)定性(圖1C)。PbSe QDs的光電流產(chǎn)生機(jī)理如下：當(dāng)能量等于或大于其帶隙能量的光子激發(fā)PbSe QDs時(shí)，分別在導(dǎo)帶(CB)和價(jià)帶(VB)上形成電子和空穴。光生電子從PbSe的CB轉(zhuǎn)移至溶液中的電子受體，光生空穴被ITO電極上的電子捕獲，產(chǎn)生陰極光電流。在Zn2+存在下，ITO/PbSe電極的光電流顯著增強(qiáng)(圖1D)。這是由于Zn2+的離子半徑小于Pb2+，即ZnSe的晶格能高于PbSe的晶格能，因此Zn2+能和PbSe中的Pb2+發(fā)生陽離子交換反應(yīng)形成ZnSe[19]。采用X射線光電子能譜(XPS)對通過Zn2+處理前后的ITO/PbSe電極進(jìn)行全掃描(圖2A)，通過Zn2+處理ITO/PbSe電極后可觀察到明顯的Zn 2p峰，表明PbSe QDs表面形成了ZnSe。分別對Pb 4f，Zn 2p和Se 3d進(jìn)行高分辨率XPS光譜分析(圖2B-D)，其中B圖在137.3 eV和142.4 eV處的結(jié)合能分別為Pb 4f7/2和Pb 4f5/2的自旋軌道，C圖在1 025.14 eV的結(jié)合能歸屬于Zn 2p3/2自旋軌道，而D圖的52.98 eV和53.8 eV的結(jié)合能則分別為Se 3d5/2和Se 3d3/2自旋軌道。根據(jù)價(jià)帶和導(dǎo)帶的帶隙位置，表明PbSe QDs表面沉積ZnSe后，形成了ZnSe/PbSe/ZnSe量子阱(QW)結(jié)構(gòu)，由于這種結(jié)構(gòu)界面處(即PbSe/ZnSe界面)的晶格錯配產(chǎn)生壓電極化電荷，這些極化電荷導(dǎo)致在PbSe層形成三角形勢阱。正/負(fù)壓電電荷在左/右側(cè)累積，從而在QW中引起能帶的線性傾斜，然后電子和空穴的波函數(shù)在傾斜帶中以相反的方向分離，將波函數(shù)重疊減小到較低的輻射復(fù)合率[20-21]，從而產(chǎn)生更多的光生載流子，使陰極光電流得到極大提高。

圖1 PbSe QDs的XRD(A)及TEM圖(B)，ITO/PbSe電極的光穩(wěn)定性測試(灰色區(qū)域?yàn)楣庹諚l件下，C)，及0.1 mmol/L Zn2+存在下ITO/PbSe電極的光電流響應(yīng)(D)Fig.1 XRD(A)and SEM(B)images of PbSe QDs,the operational stability test of ITO/PbSe electrode(the grey area are on illumination,C),and photocurrent response of ITO/PbSe QDs electrode in the presence of 0.1 mmol/L Zn2+(D)

2.3 分離式檢測原理

根據(jù)Zn2+可以增強(qiáng)ITO/PbSe電極的陰極光電流這一現(xiàn)象，本文設(shè)計(jì)了分離式陰極PEC檢測E.coliO157∶H7的方法。其檢測原理如圖3所示：選擇抗菌肽Magainin I和Magainin I-C來識別E.coliO157∶H7[22]。這是由于相比較于抗體，抗菌肽具有在惡劣環(huán)境條件下依然保持活性，不會使細(xì)菌產(chǎn)生抗性，以及低濃度下也能起識別作用等優(yōu)點(diǎn)[23]。首先，通過GMBS將Magainin I固定在微孔板上以識別E.coliO157∶H7，再引入TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復(fù)合物(選TGA-ZnS QDs作為示蹤劑是因?yàn)槠湟子诤铣汕铱杀籋NO3溶解產(chǎn)生Zn2+)使其結(jié)合E.coliO157∶H7。通過TGA-ZnS QDs產(chǎn)生Zn2+與ITO/PbSe電極表面上的Pb2+交換，增強(qiáng)陰極光電流。通過UV-Vis吸收光譜法可觀察到TGA-ZnS和Magainin I-C的特征吸收峰，證實(shí)了TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復(fù)合物的成功合成(圖4)。

圖2 ITO/PbSe電極及其用0.1 mmol/L Zn2+處理后的全掃描XPS光譜(A)；Pb 4f(B)，Zn 2p(C)及Se 3d(D)的高分辨率XPS光譜Fig.2 Full-scan XPS spectra of ITO/PbSe QDs before and after reacting with 0.1 mmol/L Zn2+(A),high-resolution XPS spectra of Pb 4f(B),Zn 2p(C)and Se 3d(D)

圖3 E.coli O157∶H7的分離式PEC生物測定示意圖(A)，Zn2+與PbSe QDs中Pb2+的交換示意圖(B)，及與Zn2+反應(yīng)后ITO/PbSe電極信號的產(chǎn)生機(jī)理(C)Fig.3 Schematic diagram of the split-type PEC bioassay for E.coli O157∶H7(A),diagrammatic sketch of Zn2+exchange with Pb2+of PbSe QDs(B),and the signal generation mechanism of ITO/PbSe electrode after treated with Zn2+(C)

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)對E.coliO157∶H7的最佳檢測，本文優(yōu)化了生物反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，通過研究發(fā)現(xiàn)E.coliO157∶H7和Magainin I的孵育溶液pH值和孵育時(shí)間對檢測結(jié)果影響較大。首先對孵育溶液的pH從偏酸性開始考察，隨著pH值的提高，體系的光電流增強(qiáng)，當(dāng)pH值7.4時(shí)體系的光電流強(qiáng)度最大，隨著pH值的繼續(xù)增大，光電流反而減弱,因此本實(shí)驗(yàn)選擇孵育溶液的最佳pH值為7.4(圖5)。此外，隨著孵育時(shí)間的增加，檢測體系的光電流也在增強(qiáng)，當(dāng)孵育30 min后，檢測體系的光電流不再隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)，表明體系已達(dá)到飽和狀態(tài)，因此實(shí)驗(yàn)選擇30 min為最佳孵育時(shí)間。

圖5 pH值的影響Fig.5 Effect of pH value

圖4 TGA-ZnS QDs(a)、Magainin I-C(b)及TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復(fù)合物(c)的UV-Vis吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of TGA-ZnS QDs(a),Magainin I-C(b) and TGA-ZnS QDs/Magainin I-C bioconjugates(c)

2.5 E.coli O157∶H7的PEC分析及與其他檢測方法的比較

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，體系的光電流強(qiáng)度(ΔI)隨著E.coliO157∶H7濃度(C,CFU/mL)的升高而升高，在10.0～5.0×106CFU/mL范圍內(nèi)呈線性增強(qiáng)，線性方程為ΔI=0.37logC-0.38，檢出限(LOD，S/N=3)為4.0 CFU/mL。表1對本方法及其它檢測E.coliO157∶H7的方法進(jìn)行比較，如電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[24]、免疫色譜法(ICA)[25]、電化學(xué)發(fā)光法(ECL)[26]及電化學(xué)法(EC)[5-7,27]?？梢钥闯觯疚乃_發(fā)的分離式PEC檢測法在靈敏度和線性范圍方面具有明顯優(yōu)勢。

圖6 E.coli O157∶H7(5.0×105 CFU/mL)與其它干擾物(1.0×106 CFU/mL)的響應(yīng)Fig.6 Response for E.coli O157∶H7(5.0×105 CFU/mL)and other interferents(1.0×106 CFU/mL)

2.6 干擾菌的影響

除檢測目標(biāo)致病菌E.coliO157∶H7外，PEC傳感器還用于檢測非致病性大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、沙門氏菌(Salmonella)以及銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、李斯特菌(Listeria)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)4種革蘭氏陽性菌以評估該方法的選擇性(圖6)。結(jié)果顯示，除沙門氏菌外，其他幾種物質(zhì)均未產(chǎn)生明顯的光電流變化。這是由于Magainin I與Magainin I-C僅特異性結(jié)合帶有O-抗原側(cè)鏈脂多糖(LPS)的細(xì)胞膜[28-29]。本文的工作可用于區(qū)分致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌以及革蘭氏陰性與陽性菌，意味著基于抗菌肽的傳感器具有檢測革蘭氏陰性細(xì)菌的潛力。但本傳感器不能區(qū)分革蘭氏陰性致病菌大腸桿菌與沙門氏菌，其主要原因是兩者細(xì)胞膜具有相似的結(jié)構(gòu)，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致[30]；由于E.coliO157∶H7一般污染施過糞肥的農(nóng)產(chǎn)品[31]，而肉類產(chǎn)品一般在運(yùn)輸或牲畜屠宰過程中受沙門氏菌污染[32]。因此，本文開發(fā)的傳感器雖不能區(qū)分這兩種菌，但可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。

表1 不同檢測E.coli O157∶H7方法的比較Table 1 Comparison with different methods for detection of E.coli O157∶H7

(續(xù)表1)

MethodMaterialLinearrange(CFU/mL)LOD(CFU/mL)ReferenceECLRucomplex5.0×102～5.0×1051.3×102[26]ECPPy/AuNP/MWCNT30.0～3.0×10730.0[5]ECrGO-NR-Au@Pt4.0×102～4.0×1084.5×102[6]ECFc1.0×103～1.0×1081.0×103[7]ECrGOPE1.5×102～1.5×1071.5×102[27]PECPbSeQDs10.0～5.0×1064.0Thiswork

*：no data

2.7 實(shí)體樣的檢測

為了評估該P(yáng)EC傳感器用于實(shí)際樣品檢測的可行性，分別檢測了生菜和菠菜濾液中E.coliO157∶H7的含量，結(jié)果見表2。檢測結(jié)果與檢測微生物的標(biāo)準(zhǔn)法(平板計(jì)數(shù)法)檢測結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算出t值小于t0.1,4(2.13)，表明本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法具有良好的一致性。

通過標(biāo)準(zhǔn)加入法在自來水和胡蘿卜汁(購自超市)中分別添加1.00×102、1.00×104和1.00×106CFU/mL 3種濃度(平板計(jì)數(shù)法讀出)的滅活E.coliO157∶H7，以計(jì)算本方法的加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示，本方法未在自來水或胡蘿卜汁中檢出E.coliO157∶H7，說明本實(shí)驗(yàn)所用的自來水和胡蘿卜汁中的E.coliO157∶H7含量未在檢測范圍內(nèi)，均符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。測得本方法的回收率為94.7%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%～2.8%。表明本文建立的抗菌肽的分離式PEC策略在實(shí)際應(yīng)用中具有較好的效果(表3)。

表2 生菜和菠菜中E.coli O157∶H7含量的檢測Table 2 Detection of E.coli O157∶H7 content in lettuce and spinach (n=5)

*was figured by means of at-test statistical analysis between two methods

表3 自來水和胡蘿卜汁中E.coli O157∶H7的加標(biāo)回收率Table 3 Spiked recoveries of E.coli O157∶H7 in tap water and carrot juice (n=5)

* no detected

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)通過在PbSe QDs表面形成ZnSe并構(gòu)成ZnSe/PbSe/ZnSe 量子阱(QW)結(jié)構(gòu)，能明顯提高PbSe的陰極光電流。這是量子阱結(jié)構(gòu)在PEC研究中的新應(yīng)用?；诖?，開發(fā)了一種分離式陰極PEC檢測E.coliO157∶H7的新方法，E.coliO157∶H7的檢測范圍為10.0～5.0×106CFU/mL，檢出限為4.0 CFU/mL。與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本PEC分析法無需進(jìn)一步孵育、方便快速，有望為食品安全、環(huán)境衛(wèi)生等領(lǐng)域監(jiān)測E.coliO157∶H7提供一種快速高效的途徑。