基于智能手機(jī)定量檢測多種心肌指標(biāo)物濃度的方法研究

李 偉,陳淑靜,戴 博*,鄭璐璐,劉 華

(1.上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院,光學(xué)儀器與系統(tǒng)教育部工程研究中心,上海 200093；2.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院 心內(nèi)科,上海 200030)

心血管疾病是危害人類健康的一大殺手,是慢性病的主要致死原因之一。研究報(bào)告顯示,2016年因心血管疾病死亡的人數(shù)超過1 790萬,占全球死亡人數(shù)的31%,預(yù)計(jì)到2030年死亡人數(shù)將增加至2 360萬[1-3]。然而,只要早期診斷、監(jiān)測合理,大多數(shù)心血管疾病是可以預(yù)防和治愈的[4-5]。因此,亟待建立一種低成本、操作簡單的技術(shù)用于心血管疾病的診斷和監(jiān)測。目前,檢測患者體內(nèi)心肌指標(biāo)物的含量是診斷心血管疾病的常規(guī)方法,如通過檢測心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)的含量對急性心肌梗死癥狀進(jìn)行診斷,檢測心肌肌鈣蛋白I/心肌肌鈣蛋白T(cTnI/cTnT)含量可診斷慢性心力衰竭。最新研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)、生長刺激表達(dá)基因2蛋白(ST2)和正五聚蛋白3(PTX3)是診斷特發(fā)性心房顫動(dòng)中的心臟損傷、心力衰竭和急性心肌梗死癥狀的循環(huán)生物標(biāo)志物[6-8]。MMP9是由巨噬細(xì)胞或炎性細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶家族蛋白的成員,與心肌損傷和血管動(dòng)脈瘤[9-11]等許多心血管疾病密切相關(guān)。ST2是由重組人白介素1受體樣1(IL1RL1)基因編碼的白細(xì)胞介素1家族蛋白成員,其響應(yīng)于心力衰竭或心肌梗塞的惡化[12-14]。PTX3是由巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞響應(yīng)初級(jí)炎癥刺激產(chǎn)生的長五聚蛋白。心肌梗死后患者血清中PTX3水平會(huì)迅速上升[15-17]。因此,即時(shí)檢測MMP9、ST2和PTX3的含量對心血管疾病的診斷具有重要意義。

隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,手機(jī)的功能也在不斷完善,從傳統(tǒng)功能單一的通信設(shè)備變得越來越智能化。不僅如此,智能手機(jī)的普及率也越來越高,手機(jī)被人們用來拍照、跟蹤定位、收發(fā)信號(hào)、分析處理數(shù)據(jù)等[18]。由于智能手機(jī)成本較低、體積小巧、功能多樣,研究者開發(fā)了許多基于智能手機(jī)的檢測診斷設(shè)備[19-21]。如應(yīng)用智能手機(jī)進(jìn)行pH值檢測[22-23]、生物標(biāo)記物檢測[24-25]、胃腸炎檢測[26]、瘧疾檢測[27]等。因此,借助智能手機(jī),建立一種低成本并且簡單快速檢測心肌指標(biāo)物的方法也逐漸成為可能。

本文建立了一種基于智能手機(jī)比色法定量檢測MMP9、ST2和PTX3 3種心肌指標(biāo)物濃度的檢測系統(tǒng),通過手機(jī)對反應(yīng)溶液拍照,拍照結(jié)果上傳服務(wù)器后采用比色算法分析處理,再將檢測結(jié)果返回顯示在手機(jī)界面上。通過對實(shí)際血清樣品進(jìn)行檢測,并與商用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果進(jìn)行對比,驗(yàn)證了系統(tǒng)的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

人MMP9免疫測定試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)VAL113)、人ST2/IL-33 R免疫測定試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)VAL114)和人Pentraxin 3/TSG-14免疫測定試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)DPTX30)均購于美國R&D Systems，上述試劑盒內(nèi)均包含聚苯烯微孔條、一抗、酶標(biāo)檢測抗體、指標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品、檢測液、濃縮稀釋液、濃縮洗滌液、顯色劑A、顯色劑B、終止液、封板膠紙。移液槍(德國艾本德公司)；Infinite M200商用酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；白光貼片式LED(湖北匡通電子股份有限公司)；勻光片(雄達(dá)塑膠亞克力廠)。

測試使用智能手機(jī)為iPhone 5,該手機(jī)使用標(biāo)準(zhǔn)的紅、綠、藍(lán)CMOS圖像傳感器,拍照時(shí)相機(jī)的白平衡和ISO感光度設(shè)置成固定值,快門速度設(shè)置為1/2584 s。

1.2 心肌指標(biāo)物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

按照試劑盒中說明書要求配制好稀釋液、洗滌液和標(biāo)準(zhǔn)品。對于血清樣本均預(yù)先進(jìn)行100倍稀釋,確保稀釋后的血清樣本光吸收度和藍(lán)色通道下的響應(yīng)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

1.2.1 MMP9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)首先向包被上一抗的微孔中加入100 μL檢測液,再將100 μL樣本加入相應(yīng)的微孔中,用封板膠紙封住微孔,室溫下孵育2 h。孵育完成后將微孔洗滌4次,向相應(yīng)的微孔中加入200 μL酶標(biāo)檢測抗體,室溫下孵育60 min。孵育完成后將微孔洗滌4次,向微孔中加入200 μL底物溶液,并將微孔在室溫下避光孵育30 min。最后向相應(yīng)的微孔中加入50 μL終止液,于15 min內(nèi)測量反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.2 ST2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)首先向包被上一抗的微孔中加入50 μL檢測液,再將50 μL樣本加入相應(yīng)的微孔中,用封板膠紙封住微孔,室溫下孵育2 h。孵育完成后將微孔洗滌4次,向相應(yīng)的微孔中加入100 μL酶標(biāo)檢測抗體,室溫下孵育2 h。孵育完成后將微孔洗滌4次,向微孔中加入200 μL底物溶液,并將微孔在室溫下避光孵育30 min。最后向相應(yīng)的微孔中加入100 μL終止液,于15 min內(nèi)測量反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3 PTX3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)首先向微孔中加入200 μL一抗,室溫下孵育60 min。孵育完成后微孔洗滌2次,將100 μL的防腐劑加入血清樣本中進(jìn)行預(yù)處理。然后每孔加入100 μL檢測液,再將20 μL樣本加入相應(yīng)的微孔中,用封板膠紙封住微孔,室溫下孵育2 h。孵育完成后將微孔洗滌4次,向相應(yīng)的微孔中加入200 μL酶標(biāo)檢測抗體,室溫下孵育2 h。孵育完后將微孔洗滌4次,向微孔中加入200 μL底物溶液,并將微孔在室溫下避光孵育30 min。最后向相應(yīng)的微孔中加入50 μL終止液,在15 min內(nèi)測量反應(yīng)產(chǎn)物。

將需要檢測的微孔置于96微孔板上,然后將微孔板放入商用酶標(biāo)儀內(nèi)檢測,檢測主波長設(shè)置為450 nm,輔助波長為540 nm。以商用酶標(biāo)儀的測出結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),并與后續(xù)研制的檢測系統(tǒng)測出的讀數(shù)進(jìn)行比對。

1.3 檢測系統(tǒng)搭建

自制微孔條照明器件的三維示意圖及LED燈光譜圖見圖1A。微孔條照明器件底部放置一塊LED陣列電路板,共8盞LED燈,每盞LED燈正對著4個(gè)微孔的正中心。LED的性能通過積分球系統(tǒng)(杭州浙大三色儀器有限公司)進(jìn)行分析測量,LED燈的光譜覆蓋可見光范圍,即380～780 nm,主波長為480 nm。電路板上方裝有雙面磨砂2 mm厚的勻光片,勻光片的透射率為88%,透射霧度為98%。勻光片可以讓LED發(fā)射的燈光均勻照亮每個(gè)微孔的底部。勻光片上方利用3D打印技術(shù),打印出一個(gè)有著4×8形式的柵格,用來安裝微孔條便于檢測。微孔條中每個(gè)微孔的容量為400 μL,微孔直徑為6.8 mm,高度為12 mm,孔壁厚度為0.65 mm,微孔均為圓孔平底,材質(zhì)為聚苯乙烯。照明器件的實(shí)物圖如圖1B所示,整個(gè)照明器件由兩節(jié)7號(hào)電池供電,長度為73 mm,寬度為54 mm,高度為37 mm,重量為56 g。

搭建的檢測系統(tǒng)三維示意圖如圖1C所示。檢測時(shí),微孔條照明器件被打開,在微孔條照明器件外放置一個(gè)3D打印的黑盒。放置黑盒可以規(guī)避環(huán)境光的干擾,確保手機(jī)拍照結(jié)果準(zhǔn)確。黑盒上方開有直徑15 mm的小孔,手機(jī)攝像頭正對圓孔放置,對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行拍照。檢測系統(tǒng)實(shí)物照片如圖1D所示。黑盒長80 mm,寬60 mm,高180 mm。

圖1 微孔條照明器件示意圖與LED燈光譜圖(A)、微孔條照明器件實(shí)物圖(B)、基于智能手機(jī)檢測系統(tǒng)的示意圖(C)以及檢測系統(tǒng)實(shí)物圖(D)Fig.1 Schematic diagram of the portable illumination gadget and spectral distribution of the LED(A),photo of the home-made illumination gadget with dimensions(B),schematic diagram of the detection system(C) and photo of the smartphone based detection system with dimensions(D)

2 結(jié)果與討論

2.1 智能手機(jī)檢測原理與過程

本研究所用自定義手機(jī)應(yīng)用程序(Cardiovascular disease care)界面和檢測原理流程圖見圖2。由圖可見,應(yīng)用程序打開后,首先選擇需檢測的實(shí)驗(yàn)指標(biāo),然后選擇需上傳的圖片,最后點(diǎn)擊“Next”按鈕,圖片便自動(dòng)上傳至服務(wù)器端(遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī))。服務(wù)器端再通過基于MATLAB編寫的自動(dòng)分析軟件對圖片進(jìn)行比色分析。等待60 s后,服務(wù)器會(huì)將檢測的結(jié)果返回手機(jī)并顯示在應(yīng)用程序的界面上。

對于服務(wù)器端,首先將上傳的圖片存儲(chǔ)進(jìn)數(shù)據(jù)庫,接著從圖片中每個(gè)微孔的正中心提取一組15×15的像素陣列,分離出這些像素陣列的紅、綠、藍(lán)三色通道。對于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),提取出藍(lán)色通道的響應(yīng)值進(jìn)行后續(xù)的比色分析,提取出的藍(lán)色通道響應(yīng)值在0～255之間。隨后,根據(jù)預(yù)先設(shè)定的微孔條位置信息,以第一列為標(biāo)準(zhǔn)樣本,剩余三列為未知樣本,對像素陣列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣本和未知樣本的區(qū)分。

對于標(biāo)準(zhǔn)樣本,先計(jì)算15×15像素陣列下藍(lán)色通道響應(yīng)的平均值,記為VStd,其中空白孔(去離子水作為樣本)的平均響應(yīng)值記為VStdBlank。再根據(jù)公式(1)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)樣本在藍(lán)色通道下的實(shí)際響應(yīng)值RStd。

RStd=lg(VStdBlank/VStd)

(1)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本在藍(lán)色通道下的實(shí)際響應(yīng)值RStd,利用四參數(shù)擬合模型繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于后續(xù)對未知樣本濃度進(jìn)行計(jì)算。對于未知樣本,同理,先計(jì)算出15×15像素陣列在藍(lán)色通道響應(yīng)下平均值,記為VTest。再根據(jù)公式(2)計(jì)算出未知樣本藍(lán)色通道下的實(shí)際響應(yīng)值RTest。

RTest=lg(VStdBlank/VTest)

(2)

其中VStdBlank代表空白孔在藍(lán)色通道下的平均響應(yīng)值。將RTest代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中,反推出未知樣本的濃度,記為ConTest。最后將計(jì)算結(jié)果存儲(chǔ)于服務(wù)器的數(shù)據(jù)庫,同時(shí)將結(jié)果發(fā)送至手機(jī)并顯示在應(yīng)用程序界面上。

圖2 自定義智能手機(jī)應(yīng)用程序的屏幕截圖和基于圖像比色算法的檢測流程圖Fig.2 Screenshots of the customized smartphone app and the flowchart of the detection principle based on colorimetric algorithm

2.2 顏色通道選擇

在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中,當(dāng)終止液加入后,溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S綠色。MMP9、ST2和PTX3 3種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)由自定義比色算法提取出的15×15像素陣列見圖3A。由圖可見,隨著質(zhì)量濃度增加,3種反應(yīng)溶液的顏色也在相應(yīng)加深。其中空白孔的顏色為淡藍(lán)色,是因?yàn)長ED的峰值波長為480 nm,呈現(xiàn)藍(lán)色。然后像素陣列被分成紅綠藍(lán)三色通道,每個(gè)像素陣列的灰度范圍為0～255。3種溶液標(biāo)準(zhǔn)品在紅綠藍(lán)三色通道下的平均響應(yīng)值VStd與濃度的關(guān)系見圖3B,其藍(lán)色通道表現(xiàn)出很寬的變化范圍,覆蓋樣品的低濃度區(qū)間到高濃度區(qū)間,隨著濃度增加,藍(lán)色通道的平均響應(yīng)值不斷減小。而紅色和綠色通道下的平均響應(yīng)值在整個(gè)濃度區(qū)間內(nèi)波動(dòng),與濃度無明顯相關(guān)性。因此,像素陣列在藍(lán)色通道下的響應(yīng)值是定量計(jì)算樣本濃度的主要因素。

圖3 MMP9、ST2和PTX3反應(yīng)溶液底部15×15像素陣列(A)以及三者分別在紅色、綠色和藍(lán)色通道下的平均響應(yīng)值(B)和實(shí)際響應(yīng)值(C)Fig.3 15×15 pixel arrays of MMP9,ST2 and PTX3(A),the average RGB values(B) and actual RGB values(C) of MMP9,ST2 and PTX3

為規(guī)避溶液本身顏色對實(shí)驗(yàn)的影響,根據(jù)公式(1)計(jì)算出3種溶液的標(biāo)準(zhǔn)樣本分別在紅綠藍(lán)通道下的實(shí)際響應(yīng)值RStd,其與濃度的關(guān)系圖見圖3C。由圖可見,藍(lán)色通道下的實(shí)際響應(yīng)值具有較寬的變化范圍,隨著濃度的增加,響應(yīng)值不斷增加,并與濃度呈現(xiàn)出一定的遞增關(guān)系,表明可通過擬合模型進(jìn)行擬合。而綠色和紅色通道的變化范圍則較小,隨濃度增加變化不大,表明這2種顏色通道在所研究的3種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中并不敏感。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對各顏色通道的敏感性進(jìn)行驗(yàn)證?；?種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別在紅綠藍(lán)三色通道下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),計(jì)算它們的變化范圍(響應(yīng)的最大值與最小值間的差異)和最大不確定度(最大的標(biāo)準(zhǔn)差),并分別記為Range和Uncertaintymax。以變化范圍為信號(hào),最大不確定度為噪聲,計(jì)算每個(gè)顏色通道下的信噪比,記為Range/Uncertaintymax,結(jié)果見表1。與紅色、綠色通道下的實(shí)際響應(yīng)值相比，MMP9、ST2和PTX3 3個(gè)試驗(yàn)中藍(lán)色通道下的實(shí)際響應(yīng)值均具有最大的信噪比,分別為54.7832、25.4197和31.9247。而紅色和綠色通道的信噪比較低,故對溶液顏色進(jìn)行分析時(shí)采用藍(lán)色通道下的實(shí)際響應(yīng)值進(jìn)行處理。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

通常情況下,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)濃度和響應(yīng)的關(guān)系可以通過四參數(shù)擬合模型進(jìn)行表征[28]。四參數(shù)擬合模型如公式(3)所示。

y=P1+(P2-P1)/[1+(x/P3)P4]

(3)

其中,y為樣本在藍(lán)色通道下的響應(yīng)值；x是濃度；P1是曲線的上漸近線估值；P2是下漸近線估值；P3是濃度對應(yīng)于最小響應(yīng)與最大響應(yīng)估計(jì)值之間的中間值；P4是曲線的斜率值。

表1 顏色通道分析Table 1 Color channel analysis

圖4 MMP9、ST2和PTX3的基于圖像比色算法和酶標(biāo)儀測得數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curves of MMP9,ST2 and PTX3 obtained by the proposed method and the commercial plate reader

MMP9、ST2和PTX3根據(jù)圖像比色法測得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線與商用酶標(biāo)儀檢測數(shù)據(jù)繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比見圖4。MMP9、ST2、PTX3標(biāo)準(zhǔn)樣本質(zhì)量濃度范圍分別為0.313～20、0.031 3～2、0.313～20 ng/mL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本的濃度值和相應(yīng)藍(lán)色通道下的實(shí)際響應(yīng)值繪制出相應(yīng)的點(diǎn)坐標(biāo),通過四參數(shù)擬合模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,得MMP9、ST2和PTX3 3種心肌指標(biāo)物在藍(lán)色通道下響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合系數(shù)(r2)分別為0.999 7、0.999 8和0.999 8,表明線性良好。同理,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本濃度和商用酶標(biāo)儀檢測出的光吸收度,繪制出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得MMP9,ST2和PTX3在酶標(biāo)儀光吸收度下的r2分別為0.999 5、0.999 3和0.999 6,表明擬合曲線效果良好。對比發(fā)現(xiàn)2種方法擬合曲線趨勢相近,表明可根據(jù)藍(lán)色通道下的標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知樣本在藍(lán)色通道下的實(shí)際響應(yīng)值推算未知樣本的濃度。

2.4 臨床樣本分析

取實(shí)際臨床樣本，分別在優(yōu)化條件下應(yīng)用本檢測系統(tǒng)和商用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,得MMP9、ST2和PTX3的濃度關(guān)系圖(圖5)。商用酶標(biāo)儀檢測出的指標(biāo)物質(zhì)量濃度(x)與自定義手機(jī)應(yīng)用程序檢測出的指標(biāo)物質(zhì)量濃度(y)呈線性關(guān)系,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如圖5A、C、E所示。結(jié)果顯示,MMP9、ST2和PTX3在臨床血清樣本質(zhì)量濃度范圍分別為0.10～1.87、0.12～1.84、0.30～7.0 ng/mL,樣本個(gè)數(shù)分別為41、43、40個(gè),通過計(jì)算，得2種檢測方法的線性相關(guān)性分別為99.50%、99.11%和98.93%,表明本方法與商用酶標(biāo)儀測得數(shù)據(jù)具有很強(qiáng)的線性相關(guān)性。

另一種在臨床檢測中常用的方法是根據(jù)Bland-Altman圖(B&A圖)分析2種檢測方法之間的一致性[29]。誤差百分比計(jì)算公式為Difference percent=(ConCDC-ConCPR)/[(ConCDC+ConCPR)/2]；式中,ConCDC和ConCPR分別為通過圖像比色法和商用酶標(biāo)儀檢出的指標(biāo)物濃度值。本方法和商用酶標(biāo)儀測得的MMP9、ST2、PTX3數(shù)據(jù)繪制的B&A圖見圖5B、D、F。將2種檢測方法所測結(jié)果的誤差百分比的平均值記為Mean,標(biāo)準(zhǔn)差記為SD。結(jié)果顯示,MMP9、ST2和PTX3檢測結(jié)果的平均值分別為1.35%、-3.60%和1.18%,分別有95.12%、97.67%和95.00%的百分比誤差點(diǎn)落在平均值加減2倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi),相應(yīng)的范圍分別為-7.51%～10.22%、-22.23%～15.03%和-11.89%～14.26%。由此可見,2種方法一致性較好。

3 結(jié) 論

本文研制了一套心肌指標(biāo)物的定量檢測系統(tǒng),可通過手機(jī)拍照,利用自定義的比色算法計(jì)算未知樣本的濃度,并在手機(jī)界面顯示。將其應(yīng)用于患者血清樣本中MMP9、ST2和PTX3 3種心肌指標(biāo)物濃度的檢測,結(jié)果與商用酶標(biāo)儀具有良好的線性相關(guān)性和一致性。該技術(shù)可廣泛應(yīng)用于資源匱乏的經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū),為這些地區(qū)的患者提供一種簡單快速的心血管疾病診斷方法。

圖5 本方法測量指標(biāo)物濃度和商用酶標(biāo)儀測得濃度的關(guān)系圖(A、C、E)和相對誤差圖(B、D、F)Fig.5 Comparison between the results of biomarkers concentration measured by the proposed method and the reference values obtained by the commercial plate reader(A,C,E) and the percentage difference of the results(B,D,F)