香茅醇不同旋光異構(gòu)體對抑制茶炭疽病病菌活性的比較及其協(xié)同作用

向曉龍，楊文，劉惠芳，陳瑤，周玉鋒，胡安龍*

香茅醇不同旋光異構(gòu)體對抑制茶炭疽病病菌活性的比較及其協(xié)同作用

向曉龍1，楊文2*，劉惠芳2，陳瑤2，周玉鋒2，胡安龍1*

1. 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006

采用菌絲生長速率法、Horsfall方法和共毒系數(shù)法測定了香茅醇不同構(gòu)型對茶炭疽病病菌（）的毒力以及兩構(gòu)型不同比例混配的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果表明，右旋香茅醇和左旋香茅醇對茶樹炭疽病菌的EC50分別為(113.27±0.95)?mg·L-1和(119.87±0.20)?mg·L-1。按照質(zhì)量比1.6︰1將右旋香茅醇和左旋香茅醇混配，協(xié)同增效作用最高，共毒系數(shù)為130.19；質(zhì)量比為1︰1.4和1︰3.8時，共毒系數(shù)分別為120.57和121.42，也具有協(xié)同增效作用。結(jié)果表明，香茅醇及兩旋光異構(gòu)體對抑制茶炭疽病菌具有良好的活性，將兩者按一定比例混用后具有增效作用。

植物源農(nóng)藥；香茅醇；茶炭疽病

茶炭疽病是我國茶園中常見的主要病害之一，在高溫高濕天氣發(fā)病較重，在茶葉上可形成大型斑塊，并造成茶樹大量落葉，該病可使投產(chǎn)茶園秋茶減產(chǎn)15%~30%，嚴(yán)重的達到40%~50%，造成茶樹產(chǎn)量與茶葉品質(zhì)都下降[1]。茶樹上登記防治茶炭疽病的殺菌劑有吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、多抗霉素和代森鋅等[2-4]，施用化學(xué)農(nóng)藥是目前防治茶炭疽病的主要手段。目前世界各茶葉進口國加強了茶葉農(nóng)藥最大殘留的限制，使得防治茶樹病害的化學(xué)農(nóng)藥不宜使用。隨著我國化學(xué)農(nóng)藥減施增效戰(zhàn)略實施和茶葉產(chǎn)業(yè)的國際化、現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化的推進，茶園減施，甚至不施化學(xué)農(nóng)藥也將成為必然趨勢。為了有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，利用植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)對茶樹病害進行防控是有效的防治途徑之一，其中利用蘆柑皮、艾蒿等提取物及山蒼子等植物精油來抑制茶炭疽病成為研究熱點[5-7]。

香茅醇（Citronellol）來源于天然植物，是由兩種異戊二烯單元（C6H8）組合產(chǎn)生的單萜烯類化合物，具有很好的環(huán)境兼容性。香茅醇在芳香類植物的植物精油中普遍存在，例如天竺葵和其他芳香類植物[8]。香茅醇對許多植物病原菌均具有抑制作用，表明其在植物源農(nóng)藥開發(fā)上具有潛力。香茅醇化學(xué)名稱：3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇，由于它具有不對稱性，存在-和-兩個旋光異構(gòu)體[9]（圖1）。

圖1 香茅醇旋光異構(gòu)體

Fig.1Citronella rotatory isomer

香茅醇在植物病原菌活性的研究方面，Hsouna等[10]測定了天竺葵精油中主要的化學(xué)成分和抗菌活性，抗菌的主要化學(xué)成分是香茅醇和香葉醇等；吳建挺等[11]測定了天竺葵精油對6種植物病原真菌的抑菌活性，采用GC-MS分析后，明確了主要成分為香茅醇；蔣小龍等[12]報道了香茅精油、香茅醛和香茅醇對6種儲糧霉菌的抑菌作用，其中香茅醇的抑菌效果明顯高于香茅精油和香茅醛的；趙麗靜[13]報道了香茅醇對黃瓜菌核病菌和番茄灰霉病菌等9種病原菌有一定的抑菌作用；Pereira等[14]研究香茅醇對14株紅色毛癬菌的最低抑制濃度（MIC）值在8~1?024?mg·L-1，對多株菌種的MIC值為128?mg·L-1；李曉晴等[15]報道了-香茅醇抗念珠菌活性的體外研究，-香茅醇對61株念珠菌的MIC范圍為81.39~1?342.39?μg·mL-1。林霜霜等[16]報道了檸檬天竺葵精油主成分為-香茅醇約占32.21%，在800?mg·L-1時對番茄早疫病的抑制率達63.24%。

多數(shù)農(nóng)藥旋光異構(gòu)體存在活性差異，其中一半可能是沒有活性的，且農(nóng)藥的生產(chǎn)既污染環(huán)境又增加生產(chǎn)投入成本。香茅醇不同旋光異構(gòu)體對抑制植物病原菌的活性比較及其協(xié)同效應(yīng)的研究鮮有報道。本文比較了右旋香茅醇和左旋香茅醇對茶炭疽病菌的毒力差異及其混用的協(xié)同效應(yīng)，為茶園新型植物源殺菌劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)。有望在今后茶樹病害生物防控中發(fā)揮重要作用，并對促進茶園減施化學(xué)農(nóng)藥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及藥劑

99%右旋香茅醇購于上海阿拉丁試劑有限公司；97%左旋香茅醇[(-)--香茅醇]購于上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司），10%多抗霉素可濕性粉劑購于山西奇星農(nóng)藥有限公司，吐溫-80（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；電子天平（型號：BSA224S-CW）；恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；高溫蒸汽滅菌鍋（上海沉匯儀器有限公司）。

供試菌株：茶炭疽病菌（），由貴州省茶葉研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 香茅醇及其異構(gòu)體對茶炭疽病的室內(nèi)毒力

采用生長速率法[17]。在藥劑初篩的基礎(chǔ)上選出5個有效濃度梯度，配置成相應(yīng)的PDA毒體培養(yǎng)基，用5?mm打孔器在活化好的茶炭疽病培養(yǎng)皿沿菌絲邊緣打孔，將菌餅放入到培養(yǎng)皿中央，帶菌絲面與PDA培養(yǎng)基面相接觸，以含0.1%吐溫-80和5%無水乙醇無菌水溶液作對照，每個處理4次重復(fù)。茶炭疽病菌株由貴州省茶葉研究所提供（已純化）；將密封保存在試管內(nèi)的菌株用接種針挑取少量菌絲轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120?h，活化菌株，即可開展下一步試驗。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120?h，采用十字交叉法測得菌絲體生長直徑，計算對炭疽病病菌生長的抑制率，求出毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。生長抑制率公式：

生長抑制率=(?D1－?D2)/?D1×100%

?D1為對照菌落直徑與菌餅直徑的差值，?D2為處理菌落直徑與菌餅直徑的差值。

1.2.2 香茅醇異構(gòu)體不同組分增效配比篩選

根據(jù)Horsfall方法[18]設(shè)計混配比例。以右旋香茅醇和左旋香茅醇兩種單劑的有效中濃度EC50為基礎(chǔ)，配制兩種單劑化合物的有效中濃度藥液，按體積比(9︰1)、(8︰2)、(7︰3)、(6︰4)、(5︰5)、(4︰6)、(3︰7)、(2︰8)、(1︰9)進行混合，分別測定每組混合處理120?h后對茶炭疽病菌菌絲生長抑制率。根據(jù)體積比測度的抑制率選出較好的體積比，先配制單劑濃度梯度，再按相對應(yīng)的濃度梯度順序?qū)蓡蝿┌淳哂性鲂ё饔媒M合的體積比混配，得到增效配比混劑的濃度梯度。計算出各單劑和混劑處理后120?h的毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

根據(jù)Sun等[19]的方法求出共毒系數(shù)及增效倍數(shù)，共毒系數(shù)大于120表示具增效作用，小于80表示拮抗作用，介于80~120之間表示相加作用。以劑量對數(shù)值（）為自變量，抑制率（）為因變量，采用DPS 7.05軟件計算毒力回歸方程、抑制中濃度（EC50）、相關(guān)系數(shù)。共毒系數(shù)的計算方法參照李建明等[20]的方法：

2 結(jié)果與分析

2.1 香茅醇和香茅醇異構(gòu)體的室內(nèi)毒力

采用菌絲生長速率法，測試了香茅醇及其不同異構(gòu)體（右旋、左旋香茅醇）和10%多抗霉素（對照藥劑）對茶炭疽病菌的室內(nèi)毒力（表1）。結(jié)果表明，經(jīng)過處理后的120?h，右旋香茅醇和左旋香茅醇對茶炭疽病菌的菌絲生長抑制中濃度EC50分別為(113.27±0.95)?mg·L-1和(119.87±0.20)?mg·L-1，均低于香茅醇[(144.12±0.42)?mg·L-1]，而高于對照藥劑10%多抗霉素可濕性粉劑[(105.06±0.32)?mg·L-1]。

2.2 香茅醇異構(gòu)體組合對茶炭疽病菌菌絲抑制作用

根據(jù)單劑毒力測定結(jié)果，對右旋香茅醇和左旋香茅醇進行混配增效配比的定性篩選。結(jié)果表明（表2），處理后120?h，右旋香茅醇和左旋香茅醇的EC50體積配比為(6︰4)、(5︰5)、(4︰6)、(3︰7)和(2︰8)時，對菌絲生長的校正毒力比均大于1，表現(xiàn)為增效作用；配比為1︰9時，校正毒力比明顯小于1，表現(xiàn)出拮抗作用；其他配比的校正毒力比為1左右，表現(xiàn)出相加作用。

根據(jù)表2結(jié)果，采用共毒系數(shù)法，對右旋香茅醇和左旋香茅醇進行混配增效配比的定量篩選。由表3可見，處理后120?h，右旋香茅醇和左旋香茅醇的五組質(zhì)量比中，配比為(1∶1.4)、(1︰3.8)、(1.6︰1)時，EC50值分別為(98.05±9.02)?mg·L-1、(95.72±9.40)?mg·L-1和(89.54±8.21)?mg·L-1，共毒系數(shù)分別為120.57、121.42和130.19，均大于120，表現(xiàn)為增效作用，分別增效20.57%、21.42%和30.19%；另外兩個配比的共毒系數(shù)均介于111~120之間，表現(xiàn)為相加作用。通過兩異構(gòu)體不同質(zhì)量配比后能有效提升對茶炭疽病的毒力，EC50值除配比為1∶1配比外均低于對照藥劑（10%多抗霉素可濕性粉劑）。

3 討論

香茅醇及其異構(gòu)體（右旋香茅醇和左旋香茅醇）對茶炭疽?。ǎ┯兄^好的抑菌效果，EC50值均在150?mg·L-1以下，與Nidiry等[21]的研究結(jié)果基本一致。香茅醇屬于單萜類化合物，Knobloch等[22]報道精油成分在水中的溶解度直接關(guān)系到它們穿透細菌或真菌細胞壁的能力，決定抑菌活性的大小，根據(jù)這個理論，在今后實際加工使用中，可將其加工成水性化劑型，如微乳劑、水乳劑等，以提高親水性和抑菌活性。

表1右旋香茅醇和左旋香茅醇處理后120?h對茶炭疽病菌的毒力

Table 1 Toxicity of dextran citronellol and rhodinol against C. gloeosporioides after 120?h

表2 右旋香茅醇和左旋香茅醇EC50液混劑處理后120?h對茶炭疽病菌的毒力

注：A為右旋香茅醇，B為左旋香茅醇

Note: A: Dextral Citronellol, B: Rhodinol

注：A：右旋香茅醇；B：左旋香茅醇；P：10%多抗霉素可濕性粉劑。**，＜0.01

Note: A: Dextral Citronellol. B: Rhodinol. P: 10% Polyamphenicol WP. **,＜0.01

茶炭疽記錄和報道的病原菌有和[23]。本試驗選用進行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明香茅醇、右旋和左旋香茅醇對茶炭疽病菌（）的EC50分別為(144.12±0.42)?mg·L-1、(113.27±0.95)?mg·L-1和(119.87±0.20)?mg·L-1，香茅醛還具有抑蟲作用[12]，因此有望開發(fā)出兼具抑菌殺蟲作用的茶園新型植物源農(nóng)藥。

目前已知的商品化的農(nóng)藥中有近170余種屬于手性農(nóng)藥，包括生物農(nóng)藥、天然產(chǎn)物制劑和化學(xué)合成農(nóng)藥，除了單一純手性異構(gòu)體的商品外，還有一些手性農(nóng)藥是含高活性手性體的消旋體商品[24]。不同的旋光異構(gòu)體對藥物生物活性有著很大的影響。李琳等[25]比較了松油烯-4-醇光學(xué)異構(gòu)體對家蠅的熏蒸活性差異，結(jié)果表明松油烯-4-醇的光學(xué)異構(gòu)體對家蠅的殺蟲活性存在差異，外消旋體的活性明顯高于異構(gòu)體單體。本試驗結(jié)果右旋和左旋香茅醇兩次測定的EC50值分別為(113.27±0.95)?mg·L-1、(119.87±0.20)?mg·L-1和(118.87±11.57)?mg·L-1、(115.54±11.78)?mg·L-1，無明顯差異，表明香茅醇旋光異構(gòu)體之間無活性差異，其作用機理和作用方式的還有待進一步研究。

利用植物源農(nóng)藥和微生物農(nóng)藥或化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配能增強對病原菌的抑菌活性，達到增效作用[26]，但鮮見利用不同異構(gòu)體混配的抑菌活性研究。通過Horsfall方法[18]和共毒系數(shù)法研究表明，右旋香茅醇和左旋香茅醇的EC50質(zhì)量配比為(1︰1.4)、(1.6︰1)和(1︰3.8)時，共毒系數(shù)分別為120.57、130.19和121.42，均表現(xiàn)出增效作用。在本試驗中香茅醇兩個異構(gòu)體都具有較高的生物活性，在增效配比下活性更高?；诖耍砂幢狙芯棵鞔_的增效配比，將香茅醇研制成植物源農(nóng)藥。針對目前茶園減施化學(xué)農(nóng)藥戰(zhàn)略，下一步將進行復(fù)配藥劑加工和田間使用技術(shù)研究?？茖W(xué)合理地利用天然植物源農(nóng)藥進行茶園病蟲害防治，對我國茶葉的綠色健康發(fā)展具有重要意義。

[1] 蔡煌. 福鼎縣茶樹炭疽病危害嚴(yán)重[J]. 福建茶葉, 1992(4): 30-31.

[2] 唐美君, 郭華偉, 姚惠明, 等. 吡唑醚菌酯乳油對茶樹炭疽病的防治效果[J]. 中國茶葉, 2016(2): 17-18.

[3] 唐美君, 郭華偉, 姚惠明,等. 啶氧菌酯對茶樹炭疽病的田間防效[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 58(8): 1418-1419.

[4] 林德鋒, 吳順章, 黃大龍, 等. 漳州鐵觀音茶樹炭疽病發(fā)生規(guī)律及化學(xué)防治試驗[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 1(8): 1169-1171.

[5] 張亮, 袁爭, 朱蔚, 等. 4種植物提取物對茶炭疽病菌的體外抑制作用[J]. 植物保護, 2012, 38(4): 137-140.

[6] 陳瑤, 高秀兵, 姚雍靜, 等. 山蒼籽油與茶皂素對茶炭疽病菌的毒力[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014(11): 140-143.

[7] 張亮. 4種植物提取物對茶炭疽病菌及對茶樹防御酶的影響[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[8] Freire M M, Jham G N, Dhingra O D, et al. Composition, antifungal activity and main fungitoxic components of the essential oil of mentha piperita l [J]. Journal of Food Safety, 2012, 32(1): 29-36.

[9] 冉學(xué)光, 江煥峰, 朱新海, 等. 香茅醇的合成研究進展[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2003, 23(3): 97-101.

[10] Hsouna A B, Hamdi N. Phytochemical composition and antimicrobial activities of the essential oils and organic extracts from pelargonium graveolens growing in Tunisia [J]. Lipids in Health & Disease, 2012, 11(1): 1-7.

[11] 吳建挺, 張博, 張悅麗, 等. 天竺葵精油抑菌活性及其主要抑菌成分[J]. 北京農(nóng)業(yè), 2013(3): 4-5.

[12] 蔣小龍, 寸東義, 楊晶焰. 香茅精油、香茅醛、香茅醇對儲糧霉菌和害蟲抑制與熏殺效果的試驗研究[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 1994(1): 39-47.

[13] 趙麗靜. 苯并噻唑等三種微生物源揮發(fā)性有機化合物的農(nóng)藥活性初步研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[14] Pereira F D, Mendes J M, Lima I O, et al. Antifungal activity of geraniol and citronellol, two monoterpenes alcohols, against trichophyton rubrum involves inhibition of ergosterol biosynthesis [J]. Pharmaceutical Biology, 2015, 53(2): 228-34.

[15] 李曉晴, 惠海英, 駱志成. 香葉醇、-香茅醇和丁香酚抗念珠菌活性的體外研究[J]. 現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 31(2): 87-89.

[16] 林霜霜, 邱珊蓮, 鄭開斌, 等. 5種精油的化學(xué)成分及對番茄早疫病的抑菌活性研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2017, 33(31): 132-138.

[17] 方中達. 植病研究方法[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998: 140-141.

[18] Horsfall J G. Fungicides and their action [J]. Quarterly Review of Biology, 1945(2): 239. DOI: 10.1126/science.103.2664.87.

[19] Sun Y P, Johnson E R. Analysis of joint action of insecticides against house flies [J]. Journal of Economic Entomology, 1960, 53(5): 887-892.

[20] 李建明, 歐曉明, 裴暉, 等. Excel在殺菌劑復(fù)配研究中的應(yīng)用[J]. 世界農(nóng)藥, 2013, 35(4): 34-36.

[21] Nidiry, Eugene S J. Quantitative structure-fungitoxicity relationships of some monohydric alcohols [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(18): 5337-5343.

[22] Knobloch K, Pauli A, Iberl B, et al. Antibacterial and antifungal properties of essential oil components [J]. Journal of Essential Oil Research, 1989, 1(3): 119-128.

[23] 劉威, 陳玉森, 劉偉, 等. 茶樹炭疽病的病原鑒定及其生物學(xué)特性的研究[J]. 寧德師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 25(1): 1-5.

[24] 李超. 順硝烯新煙堿殺蟲劑的同位素標(biāo)記合成、手性分離鑒定及土壤中的歸趨研究[D]. 上海: 華東理工大學(xué), 2013.

[25] 李琳, 熊鑫, 馬樹杰, 等. 松油烯-4-醇光學(xué)異構(gòu)體及外消旋體對家蠅的殺蟲活性比較[J]. 昆蟲學(xué)報, 2015, 58(7): 761-766.

[26] 李昕. 油茶炭疽病生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥協(xié)同防治研究[D]. 長沙: 中南林業(yè)科技大學(xué), 2015.

Fungicidal Activity Comparison and Synergetic Effectof Citronellol Optical Isomers Against

XIANG Xiaolong1, YANG Wen2*, LIU Huifang2, CHEN Yao2, ZHOU Yufeng2, HU Anlong1*

1. Agricultural college of Guizhou University, Guiyang 550025, China;2. Guizhou Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China

In this study, the activities of dextral citronellol, rhodinol and their synergistic effect to thewas determined by method of mycelial growth rate, Horsfall and co-toxicity coefficient. The EC50of dextral citronellol and rhodinol were (113.27±0.95)?mg·L-1and (119.87±0.20)?mg·L-1respectively. The dextral citronellol and rhodinol were mixed according to the mass ratio. The result shows that the synergistic effect was the highest with the co-toxicity coefficient of 130.19 under the mass ratio of 1.6︰1 (dextral citronellol︰rhodinol). The co-toxicity coefficients were 120.57 and 121.42 when the mass ratio were 1︰1.4 and 1︰3.8, respectively. The results indicate that citronellol and its two optical isomers had high inhibiting activities against, and the synergistic effect could be performed by mixing them within certain proportion.

botanical fungicide, citronellol,

S435.711；S482

A

1000-369X(2019)04-425-06

2019-01-02

2019-02-11

國家重點研發(fā)計劃項目子項目[2016YFD0200900]、貴州省科技計劃項目[黔科合平臺人才(2017)5717]、貴州省農(nóng)業(yè)科技支撐項目（黔科合支撐[2016]550號）、黔農(nóng)科院青年基金[2017]14號、黔科合支撐[2018]2251

向曉龍，男，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和茶樹病蟲害研究方面的研究。*通信作者：alhu@gzu.edu.cn