一株拮抗茶炭疽病菌的木霉菌的分離、篩選及鑒定

趙興麗，張金峰，周玉鋒*，趙玳琳，張莉，周羅娜，陶剛*

一株拮抗茶炭疽病菌的木霉菌的分離、篩選及鑒定

趙興麗1，張金峰2，周玉鋒1*，趙玳琳3，張莉4，周羅娜1，陶剛3*

1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550006；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；3. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006；4. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006

為獲得對茶炭疽病有生物防治效果的拮抗木霉菌，本文采用梯度稀釋法從茶樹根際土壤中分離獲得23株木霉菌，并通過平板對峙法和抑菌圈法從中篩選出1株強(qiáng)拮抗茶炭疽病菌的木霉菌株LS17110205。該菌株對茶炭疽病菌抑菌率達(dá)76.96%，并能在茶炭疽病菌菌落上產(chǎn)生大量白色菌絲及綠色分生孢子，使茶炭疽病菌菌落萎縮，顏色變暗；其發(fā)酵液也能有效抑制茶炭疽病菌菌絲生長，抑制率達(dá)70.08%。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株LS17110205發(fā)酵液能使茶炭疽菌菌絲表面皺縮?；谛螒B(tài)學(xué)特征結(jié)合分子系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將菌株LS17110205鑒定為。該研究結(jié)果為茶炭疽病的生物防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

根際土壤；抑菌率；茶炭疽病；鑒定；木霉菌

茶炭疽病是茶樹主要病害之一，全國各地茶園均有發(fā)生，特別是在我國西南和華南茶區(qū)。該病主要由炭疽菌（s spp.）引起，病菌通常從嫩葉的背部侵入，然后萌發(fā)形成芽管侵入葉片組織[1]，在茶樹成葉上顯癥，并影響茶樹的生理代謝，使茶樹出現(xiàn)大量落葉，嚴(yán)重時會導(dǎo)致植株枯死，直接影響茶樹產(chǎn)量和茶葉品質(zhì)[2-3]。目前，茶炭疽病的防治主要是以化學(xué)藥劑為主，但過量使用藥劑會引起農(nóng)藥殘留和病原抗藥性等問題。茶葉是一種直飲品，其安全性與我們的身體健康密切相關(guān)。由于人們對環(huán)境保護(hù)和食品安全問題的重視，傳統(tǒng)化學(xué)防治方法所帶來的弊端變得更加突出。

目前，以木霉菌（spp.）等生防微生物為主要成分的生防菌劑已經(jīng)成為部分化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料替代品和減量品[4-6]。木霉菌分布廣泛[7]，存在于土壤、根圍、葉片、種子和球莖等生態(tài)環(huán)境中[8]，營腐生生活。國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，木霉菌對包括茶樹病害在內(nèi)的多種植物病害具有防治效果[9-11]，同時能夠促進(jìn)植物生長[12]。研究表明，在修剪后的茶樹切口上施用木霉菌（和）制劑，可以有效抑制茶根腐病和茶枝梢黑點(diǎn)病的發(fā)生[13]。Onsando等[14]1994年的研究中發(fā)現(xiàn)、和對茶樹根腐菌（spp.）具有較強(qiáng)的抑制作用；若在接種輪斑病菌前接種木霉菌，能顯著抑制輪斑病菌（spp.）的侵染[15]。本研究通過收集茶樹根際木霉菌資源，篩選拮抗木霉菌，并評價了菌株LS17110205對茶炭疽病菌的抑制效果，為茶樹炭疽病的生物防治提供資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

茶炭疽病菌（）為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。茶炭疽病病樣采自貴州省松桃縣正大鎮(zhèn)茶園，通過單孢分離技術(shù)獲得純化菌株，基于ITS序列和形態(tài)學(xué)特征將其鑒定為。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200?g、瓊脂粉15~20?g、葡萄糖20?g、蒸餾水1?000?mL；PDB液體培養(yǎng)基：土豆200?g、葡萄糖20?g、蒸餾水1?000?mL；虎紅酸鈉培養(yǎng)基：土豆200?g、瓊脂粉15~20?g、葡萄糖20?g、氯霉素0.3?g、虎紅鈉鹽0.02?g、蒸餾水1?000?mL；丙酸鈉培養(yǎng)基：土豆200?g、瓊脂粉15~20?g、葡萄糖20?g、慶大霉素0.05?g、丙酸鈉0.05?g、蒸餾水1?000?mL。

1.1.3 供試試劑及主要儀器

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），2×PCRMaster Mix酶[天根生化科技（北京）有限公司]。S-3400N掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.2 茶樹根際木霉菌分離與篩選

1.2.1 梯度稀釋法分離菌株

利用五點(diǎn)法從貴州省雷山縣銀球茶主產(chǎn)區(qū)采集茶樹根際土。室溫風(fēng)干，混勻。稱取10?g土樣倒入裝有90?mL滅菌蒸餾水的三角瓶中，150?r·min-1振蕩30?min，使土樣中的微生物充分混勻，得到10-1濃度的土壤懸液。在超凈工作臺中將10-1濃度的土壤懸液用滅菌蒸餾水逐一稀釋成10-2、10-3和10-4的不同濃度。靜置30?s，用移液槍分別取濃度為10-3和10-4的土壤懸液上清液100?μL滴于PDA平板上，用滅菌的涂布棒涂勻，28℃黑暗倒置培養(yǎng)至有菌落形成，取菌餅轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，重復(fù)2次，采用硫酸紙袋進(jìn)行–20℃低溫冷凍保存。

1.2.2 平板對峙法初篩

用打孔器分別取茶炭疽病菌（）與待測木霉菌菌餅，直徑為5?mm，將兩菌餅接于同一PDA平板上，相距5.5?cm，每組5個重復(fù)，以單接茶炭疽病菌為對照，置于28℃培養(yǎng)，7?d后測量茶炭疽病菌朝向木霉菌的菌落半徑，計(jì)算木霉菌的抑制率。同時統(tǒng)計(jì)木霉菌對茶炭疽病菌的覆蓋率。通過對峙培養(yǎng)挑選對茶炭疽病菌的抑制率大于或等于70%且覆蓋率為Ⅲ級的木霉菌株進(jìn)行復(fù)篩。覆蓋率分級標(biāo)準(zhǔn)參考陳書華等[16]的研究。

1.2.3 抑菌圈法復(fù)篩

無菌條件下取6個直徑為5?mm的木霉菌菌餅接入PDB培養(yǎng)基中，28℃、200?r·min-1培養(yǎng)4?d，7?830?r·min-1、常溫離心10?min，取上清液通過0.22?μm濾膜。按木霉菌發(fā)酵液∶PDA=1∶9的比例將木霉菌發(fā)酵液加入到PDA培養(yǎng)基中，混勻倒平板，取茶炭疽病菌菌餅接種于平板中央。25℃培養(yǎng)5?d，十字交叉法測量茶炭疽病菌菌落半徑，計(jì)算其抑菌效果。

1.2.4 掃描電鏡觀察

利用掃描電鏡觀察木霉菌發(fā)酵液對茶炭疽病菌菌絲的影響，具體操作如下：

（1）樣品前處理：打孔器取大小為5?mm×5?mm的茶炭疽病菌菌餅，放到2.5%戊二醛中，菌餅需完全淹沒，放入4℃冰箱中過夜，進(jìn)行固定；用0.1?mmol·L-1磷酸緩沖（PBS）洗滌3次，每次10~15?min；之后用濃度為55%、65%、75%、85%、95%以及100%叔丁醇對茶炭疽病菌菌餅進(jìn)行梯度脫水，每個濃度約10~15?min，放入冷凍干燥儀，抽真空，進(jìn)行冷凍干燥。

（2）鍍金處理：利用導(dǎo)電膠把干燥后的菌餅粘于電鏡樣品放置的底座上，體視鏡下用鑷子將菌餅完全固定，洗耳球去除表面碎屑后，進(jìn)行鍍金處理。

1.3 菌株LS17110205的鑒定

1.3.1 形態(tài)特征觀察

菌株LS17110205培養(yǎng)5?d后，挑取PDA平板上的菌落，制水玻片顯微觀察該木霉菌的形態(tài)特征并拍照。

1.3.2 基因組DNA提取、序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株LS17110205培養(yǎng)5?d后，用滅菌手術(shù)刀刮取菌絲及孢子，參照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取菌株LS17110205的基因組DNA，采用引物：ITS1/ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′/5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[17]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25?μL）：2×Master Mix 12.5?μL，DNA模板1?μL，引物各1?μL，ddH2O 9.5?μL，滅菌超純水作為對照。PCR擴(kuò)增程序分別為：94℃預(yù)變性5?min；94℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸1?min，35個循環(huán)；72℃延伸10?min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物條帶亮度后，委托上海生工公司進(jìn)行序列測定，并將所測rDNA-ITS序列通過NCBI上的BLAST軟件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性比較。BioEdit軟件對測序序列和下載自NCBI-Gen Bank的序列進(jìn)行多位點(diǎn)序列比對，并對其進(jìn)行手動校正，校正后的序列采用MEGA 5.1軟件將各基因序列按ITS→TEF的順序首尾相連，保存為fast格式，再利用格式轉(zhuǎn)換網(wǎng)站（http://www.sing-group.org/ALTER）將其轉(zhuǎn)化為phy格式，并通過最大似然法分析構(gòu)建最大似然樹（Maximum likehood phylogenetic tree）[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007和DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析，并通過LSD法比較各處理間的差異顯著性（<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹根際木霉菌分離及拮抗木霉菌的篩選

采用土壤梯度稀釋涂布法從茶樹根際土壤中分離純化得到23株木霉菌。對峙培養(yǎng)初篩表明，23株木霉菌對茶炭疽病菌都有抑制作用（圖1），其中有9株木霉菌對茶炭疽病菌的抑菌率大于70%且覆蓋率為Ⅲ級（表1）。抑菌圈法復(fù)篩結(jié)果顯示，茶炭疽病菌在含木霉菌發(fā)酵液的PDA平板上不能形成明顯的抑菌圈。通過對9株木霉菌復(fù)篩后，發(fā)現(xiàn)其中4株木霉菌對茶炭疽病菌有抑制作用（表2）。

經(jīng)初篩和復(fù)篩后，23株木霉菌中對茶炭疽病菌抑制效果最佳的為菌株LS17110205。結(jié)合表1和表2，菌株LS17110205對茶炭疽病菌的生長抑制率為76.96%，對峙培養(yǎng)5?d后該木霉菌菌絲覆蓋茶炭疽病菌菌落的3/4以上，并在茶炭疽病菌菌落上產(chǎn)生大量白色菌絲，茶炭疽病菌菌落萎縮，顏色變暗（覆蓋率為Ⅲ級）（圖1），其發(fā)酵液對茶炭疽病菌具有較強(qiáng)的抑制效果，抑制率達(dá)70.08%。掃描電鏡顯微觀察表明，與對照相比，菌株LS17110205的發(fā)酵液能使茶炭疽菌菌絲失水，表面呈褶皺狀（圖2）。

表1 拮抗木霉菌對茶炭疽病菌的抑制作用

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（0.05）。下同

Note: The data are mean±SD. Lowercase letters in the same column mean significant difference (0.05). The same below

表2 木霉菌株發(fā)酵液對茶炭疽菌的抑制作用

圖2 木霉菌株發(fā)酵液對茶炭疽菌菌絲的影響

2.2 木霉菌株LS17110205的種類鑒定

2.2.1 培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)特征描述

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5?d后，菌株LS17110205平板正面形成綠色菌落，平板背面呈現(xiàn)為綠色，無色素和特殊氣味產(chǎn)生，菌落日均生長速度約為3.8?cm·d-1，有大量氣生菌絲產(chǎn)生，有同心輪紋，菌落絨毛狀至氈狀，平板邊緣形成綠色產(chǎn)孢區(qū)。分生孢子簇棉絮狀，有單個分生孢子梗分枝，直徑約為6.99?μm；分生孢子梗上的瓶梗呈對稱分布，安瓿形，直徑約為5.19?μm；分生孢子球形至亞球形或不規(guī)則性，光滑、淡綠色，大小為(4.67~5.97)?μm ×(5.03~8.56)?μm（圖3）。根據(jù)菌株LS17110205的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)特征，初步確定其分類地位為[19-22]。

2.2.2 序列測定及多基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

木霉菌株LS17110205的rDNA-ITS基因序列GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號為MK421515。測序結(jié)果經(jīng)BLAST同源性比對的結(jié)果與下載至GenBank的部分木霉菌的ITS及TEF序列（表3）進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，選擇作為外群，構(gòu)建木霉菌的分子系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明菌株LS17110205和聚為同一分支（圖4），且具有較高的支持率，結(jié)合菌株LS17110205的形態(tài)學(xué)特征[23-25]，將該菌株鑒定為。

3 討論

茶炭疽病的發(fā)生與流行受氣候、管理和品種抗性等因素的影響，高溫高濕的環(huán)境適宜茶炭疽菌的生長與繁殖。研究表明，茶炭疽菌分生孢子可以附著在葉表面存活5個月左右[26]，茶炭疽菌分生孢子在土壤及植物組織中的長期存活會使得茶炭疽病連年發(fā)生和擴(kuò)散，給茶農(nóng)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對茶炭疽病的防治主要采用化學(xué)殺菌劑，但化學(xué)農(nóng)藥的過量和不合理的使用會造成農(nóng)藥殘留等問題，直接影響人們的身體健康和生活環(huán)境，解決這個問題關(guān)鍵是生物防治等綠色防控技術(shù)的應(yīng)用。

利用生防菌研制的生防制劑來防治茶樹炭疽病是一種綠色、安全、有效的途徑。國內(nèi)外已報(bào)道的生防菌很多，主要包括放線菌[27]、枯草芽孢桿菌[28]以及木霉菌[29]等。近年研究表明，木霉菌是一種重要的生防真菌，其生防機(jī)制主要包括：競爭營養(yǎng)和定殖位點(diǎn)、抗生作用、重寄生作用及誘導(dǎo)植物抗性等作用[30]。如馮俊清[31]等用還原糖法測定了鉤狀木霉（）不同發(fā)酵時間幾丁質(zhì)酶活力的變化，結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶活性在45?h達(dá)到最大，用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時間的木霉菌都能降解和破壞辣椒白絹病致病菌的菌絲，并推斷木霉菌生防作用的重要機(jī)制是產(chǎn)生了幾丁質(zhì)酶。而Hanhong等[32]研究發(fā)現(xiàn)木霉菌可誘導(dǎo)植株產(chǎn)生防御體系從而延緩辣椒疫病（）發(fā)生。隨著研究深入，生防木霉菌正不斷被發(fā)現(xiàn)，如姬承東等[33]通過分離和篩選獲得2株強(qiáng)拮抗木霉菌：加納木霉（）GCPL175和木霉菌株GCPL12，它們的發(fā)酵液的無菌濾液對環(huán)柄菇屬菌（spp.）1506的抑菌率分別達(dá)61.23%和73.13%；且其防控方法也在不斷改進(jìn)，如劉明鑫等[34]通過變換立枯絲核菌（）和棘孢木霉菌（）437的施用順序發(fā)現(xiàn)，木霉菌和病原菌在同時施用時對枯萎病的防效最高。為了使木霉菌能夠有效的應(yīng)用到茶樹病害綠色防控上，本研究立足茶園生境，將來自茶樹根際土壤中的木霉菌資源，通過初篩和復(fù)篩從中篩選獲得具有生防潛能的木霉菌株LS17110205，該菌株對茶炭疽病菌具有顯著的抑制作用，具有較強(qiáng)的開發(fā)潛能；此外還發(fā)現(xiàn)該木霉菌株的發(fā)酵液能夠使茶炭疽病菌菌絲失水皺縮，具體原因有待下一步研究。

注：A、B菌落正反面；C、H—J分生孢子梗；D、E菌絲周圍聚集大量分生孢子；F、G分生孢子簇；K、L分生孢子上的附著胞；M—S分生孢子

表3 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的真菌的種名、菌株號及GenBank登錄號

圖4 菌株LS17110205與相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹

近幾年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析在木霉菌分類研究中得到廣泛應(yīng)用[35-36]，木霉屬內(nèi)組、種之間的關(guān)系發(fā)生了較大的變化[37-38]。為了明確生防木霉菌LS17110205的分類地位，研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析，將菌株LS17110205鑒定為。

研究結(jié)果為木霉菌株LS17110205拮抗茶炭疽病菌的機(jī)制研究和木霉菌菌劑的開發(fā)利用提供前提和重要的理論基礎(chǔ)。

致謝：本文在木霉菌分離方法技術(shù)方面得到中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所顧金剛老師的幫助，特此感謝!

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Isolation, Screening and Identification of A Strain ofAntagonizing Tea Anthracnose

ZHAO Xingli1, ZHANG Jinfeng2, ZHOU Yufeng1*, ZHAO Dailin3,ZHANG Li4, ZHOU Luona1, TAO Gang3*

1. Guizhou Academy of Agricultural Sciences key laboatory of agricultural biotechnology, Guiyang 550006, China; 2. Guizhou Academy of Agricultural Sciences tea research institute, Guiyang 550006, China; 3. Guizhou Academy of Agricultural Sciences institute of Plant Protection, Guiyang 550006, China; 4. Guizhou Academy of Agricultural Sciences grass industry research institute, Guiyang 550006, China

To obtain antagonisticfor biocontrol of tea anthracnose, the twenty-threestrains were isolated fromrhizosphere-soil by taking gradient dilution. Among them, the strain LS17110205 against tea anthracnose was screened by using dual-culture and inhibition zone assay.The results show that the inhibitory rate of LS17110205 against tea anthracnose was up to 76.96% and a large number of white hyphae and green spores were produced on the colony of tea anthracnose, which caused the tea anthracnose colony to shrink and became dark. The fermentation liquid of LS17110205 was effective against pathogenhyphae, and the inhibitory rate was70.08%. The results show that the fermentation of the strain LS17110205 caused the tea anthracnose mycelia to shrink on the surface by scanning electron microscope analysis. LS17110205 was identified ason the basis of the morphological characteristicsand phylogenetic tree. The results provided theoretical basis in biocontrol of tea anthracnose.

rhizosphere-soil, inhibitory rate, tea anthracnose, identification,spp.

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2019)04-431-09

2018-12-06

2019-02-13

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-19）、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目子課題（2016YFD0200906、2017YFD0201102）、黔科合平臺人才[2017]5717號、黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項(xiàng)字[2014]009號

趙興麗，女，碩士，主要從事植物真菌病害的防治方面的研究。*通信作者：gzzhouyf@163.com，ttg729@sina.com