茶樹SRO基因家族的鑒定及表達分析

郭永春，王鵬杰，陳笛，鄭玉成，陳雪津，葉乃興

茶樹基因家族的鑒定及表達分析

郭永春，王鵬杰，陳笛，鄭玉成，陳雪津，葉乃興*

福建農林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002

（Similar to rcd one）是植物特有的基因家族。本研究利用生物信息學方法從茶樹基因組中鑒定獲得9個茶樹基因家族成員，分別命名為和。9個茶樹基因的編碼蛋白均具有特征結構域PARP和RST，具有相似的保守基序。系統(tǒng)進化樹分析聚分為3組，Ι組包含CsRCD1—4，Ⅱ組包含CsSRO1和CsSRO2，Ⅲ組包含CsSRO3—5?；蚪Y構分析表明每個基因含有4至9個外顯子。8個茶樹組織轉錄組數據分析表明，和可能在茶樹不同發(fā)育階段具有重要作用；大多數基因在根和成熟葉中較高表達。上游啟動子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)大量與植物發(fā)育、激素及脅迫響應密切相關的順式作用元件，進一步對基因在干旱和脫落酸處理下的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，9個基因均被誘導表達，基因可能與茶樹抗旱密切相關。

茶樹；；系統(tǒng)進化；干旱脅迫

植物在遭受逆境脅迫時，能夠誘導逆境響應基因表達，以在復雜多變的環(huán)境生存[1]，在這些過程中，通過應激反應參與多條調控網絡發(fā)揮作用[2-3]。SROs通常包含高度保守的PARP[poly(ADP ribose)polymerase catalytic；PS51059]催化中心和C末端的RST（RCD1-SRO-TAF4；PF12174）保守結構域[4]，部分SRO還含有N末端的WWE（PS50918）結構域[5]。

在擬南芥中，家族有6個成員，分別為和[6]。是第一個被鑒定出的擬南芥SRO家族成員[7]；可通過與細胞核中的轉錄因子相互作用，參與植物脫落酸（Abscisic acid，ABA）信號通路介導的干旱響應，還可以通過參與ABA、乙烯（Ethylene，ETH）、茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MEJA）等激素信號通路，調控植物發(fā)育[8-9]。和，這兩個同源基因在不同脅迫條件下的功能存在部分冗余[10]，參與非生物脅迫響應，其突變體對滲透和氧化等脅迫具有較強的抵抗能力[11-12]；與轉錄因子相互作用調控基因表達，過表達可以通過降低根中H2O2的水平以增加轉基因植株的耐鹽性[13]；可以響應強光、鹽處理及臭氧脅迫[4]；沒有明確的功能報道[14]。SROs在蘋果、水稻、小麥、玉米、陸地棉、番茄等作物中也有部分研究，例如，在蘋果中，可通過ABA信號通路調節(jié)氣孔孔徑，耐受干旱脅迫，并且調節(jié)根系生長[15]；在水稻中，通過調控SNAC1和DST促進水稻氣孔關閉和H2O2積累，參與干旱和氧化應激反應[16]；在小麥中，可以通過調節(jié)植物體內的氧化還原平衡來提高其耐旱能力[2]。越來越多的植物基因家族得到鑒定，SROs在干旱脅迫響應下的作用機制也日益清楚。

盡管前人對各種植物基因已進行大量研究，但有關茶樹的基因研究仍是空白。茶樹[(L.) O. Kuntze]是一種多年生常綠木本植物[17]，廣泛種植于亞洲和非洲，喜溫暖潮濕的氣候、漫射光和弱酸性土壤[18]。干旱、低溫、長期輻射、病蟲害等非生物脅迫和生物脅迫都會對茶樹生長產生不利影響[19-20]，其中干旱脅迫通過影響茶樹生長的土壤和水分條件，嚴重降低茶葉的產量和品質[21]。因而研究茶樹的抗旱分子機制，挖掘重要的抗性基因，進而通過分子育種技術獲得抗性優(yōu)良品種尤為重要。本研究基于茶樹基因組數據庫，鑒定獲得9個茶樹基因家族成員，分析CsSRO家族成員間的系統(tǒng)發(fā)育關系、外顯子-內含子結構分布及保守基序的組成，并進一步分析9個基因在茶樹組織、干旱脅迫和外源ABA處理下的表達模式。筆者旨在通過對茶樹基因家族系統(tǒng)的分析，為進一步研究基因介導生理發(fā)育過程和應激反應的分子機制奠定基礎，為今后茶樹遺傳改良提供有益的依據。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗在茶學福建省高校重點實驗室進行，試驗材料選取生長良好、長勢一致的兩年生盆栽鐵觀音茶樹。將在(24±2)℃的環(huán)境溫度下生長的植株轉移至溶液（10% PEG-6000）中進行干旱處理。將新鮮制備的100?μmol·L-1ABA溶液分別噴灑在不同處理植株的葉片上進行激素處理。收集兩種處理6、12、24、48?h后和對照（0?h未處理）的第二葉。每個處理3次重復，錫箔紙包裹標記，液氮速凍后保存于–80℃冰箱備用。

1.2 茶樹SRO基因家族成員的鑒定及序列分析

首先下載茶樹基因組數據庫中的蛋白序列（http://tpia.teaplant.org）[22]，從Pfam數據庫（https://pfam.xfam.org）下載SRO蛋白特征結構域PARP（PS51059）、RST（PF12174）和WWE（PS50918）的隱馬爾可夫模型，并使用HMMER軟件進行鑒定[23]。此外，為了進一步驗證所鑒定的茶樹基因家族，利用SMARAT（http://smart.embl-heidelberg.de）網站和NCBI的Blast-P比對確保上述候選基因至少含有1個PARP催化中心和C-末端的RST結構域。利用ExPASy（http://www.expasy. org）網站分析茶樹SRO蛋白的理化性質，在線工具WOLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）進行亞細胞定位預測。

1.3 茶樹SRO蛋白保守結構域及保守基序分析

利用EBL-EBI（http://www.ebi.ac.uk/interpro/ search/sequence-search）分析氨基酸序列的蛋白質保守區(qū)，并用IBS 1.0軟件繪制蛋白保守結構域圖，使用MEME工具（http://meme- suite.org/tools/meme）對茶樹SRO蛋白的保守基序進行分析[24]，設置基序數量參數為5個，其余為默認。

1.4 茶樹SRO基因結構及系統(tǒng)進化樹分析

從茶樹基因組數據庫中下載茶樹外顯子和內含子分布數據的存儲文件，利用GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）繪制基因結構分布圖[25]。從TAIR下載了擬南芥RCD1和SRO1—5的蛋白序列（https://www.Arabidopsis. org），與茶樹SRO家族成員一起用ClustalW默認設置對氨基酸序列進行多重序列比對, 并用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)進化樹構建，校驗參數Boostrap重復為1?000次，其他參數均為默認值[26]。

1.5 茶樹SRO基因啟動子順式元件分析

從茶樹基因組中提取基因轉錄起始位置上游2?000?bp的序列進行查找啟動子順式作用元件，在PlantCARE數據庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）進行預測[27]。

1.6 茶樹SRO基因組織特異性及脅迫表達分析

在NCBI SRA（Sequence Read Archive）數據庫上下載茶樹不同組織的轉錄組數據，包括頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、莖、根（NCBI登錄號：SRP056466）[22]。使用TopHat2軟件將轉錄組所有可用讀數映射到茶樹基因組[28]，然后通過HTseq軟件計算基因FPKM值表達水平[29]，最后對各轉錄組基因的FPKM值進行歸一化處理，使用HemI 1.0軟件制作熱圖。

1.7 RNA提取和實時熒光定量PCR

2 結果與分析

2.1 茶樹SRO基因家族的鑒定與序列分析

經過分析和驗證，最終獲得9個家族成員。通過與擬南芥家族成員的同源性進行命名，分別為—和—?；蚓幋a序列長度為489~2?622?bp，編碼氨基酸數目為162~873。通過ExPASy軟件包對蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)，茶樹SRO蛋白家族分子量在17.54~97.78?kDa，等電點為6.07~9.07，CsRCD2屬于疏水性蛋白，其他屬于親水性蛋白，CsSROs全部為堿性蛋白。亞細胞預測定位大部分CsSROs（6個）定位于細胞核，CsRCD2定位于細胞質，CsSRO1和CsSRO 5定位于葉綠體（表2）。

表2 茶樹CsSRO基因家族的序列特征

2.2 CsSRO家族蛋白結構域組成及保守基序分析

利用EBL-EBI在線分析，發(fā)現(xiàn)9個茶樹SRO蛋白成員皆含有PARP催化中心和C-末端的RST結構域，而CsRCD4不僅包含PARP和RST結構域，還含有N端的WWE結構域。由于蛋白質的氨基酸序列長度不同，其保守結構域的位置也不同（圖1）。CsRCD1、CsRCD3、CsSRO2和CsSRO5的PARP和RST結構域分別位于第220~497個氨基酸和447~586個氨基酸，CsRCD2、CsSRO3和CsSRO4的PARP和RST結構域分別位于第1~302個氨基酸和243~364個氨基酸，CsSRO1的PARP和RST結構域分別位于第2~122個氨基酸和116~162個氨基酸，CsRCD4的WWE、PARP和RST結構域分別位于第78~153個氨基酸、438~658個氨基酸和707~771個氨基酸。

在MEME工具中進行預測發(fā)現(xiàn)了茶樹SRO家族的5個保守基序（圖2）。其中，基序2和基序5高度保守，存在于每個CsSRO的氨基酸序列中，提示這兩個基序在SROs基因家族中具有重要作用，通常位于CsSRO多肽的中心和末端附近，具有典型的PARP和RST結構域。基序4只在CsRCD1—4中發(fā)現(xiàn)，CsSRO1—5缺少基序4。CsSRO1、CsSRO3還分別缺少基序1和3。結合CsSROs的結構域位置分析可以看出，基序1、基序3和基序4位于PARP保守結構域中。

注：灰色區(qū)域、黑色斜紋區(qū)域和黑色網格區(qū)域分別表示CsSROs 蛋白的WWE、PARP 和RST 結構域

圖2 茶樹SRO 家族保守基序和基序logo 分析

2.3 CsSRO家族進化樹及基因結構分析

將茶樹與擬南芥SRO家族蛋白序列使用ClustalW進行多重序列比對，然后進行系統(tǒng)進化樹構建（圖3）。結果顯示，茶樹SRO可以分為3組，CsRCD1—4與AtRCD1、AtSRO1聚為第Ι組，CsSRO1、CsSRO2聚為第Ⅱ組，CsSRO3—5與AtSRO2—5聚為第Ⅲ組，其中第Ⅰ組和第Ⅲ組同時包含了茶樹和擬南芥蛋白。第Ⅰ組中，CsRCD1、CsRCD2和CsRCD3同源性較高，第Ⅲ組中，CsSRO4和CsSRO5同源性較高，相似性均在85%以上。CsRCD1和CsRCD2、CsSRO1和CsSRO2的相似性均在99%以上，可能為旁系同源基因。

利用基因家族成員外顯子-內含子結構繪制圖譜（圖4）。家族基因中基因組序列最長的是，長度超過39?kbp；9個基因的外顯子數范圍在4到9之間。大多數基因（、3、、和）有5個外顯子，、分別有4個和6個，而和有9個外顯子。由此發(fā)現(xiàn)，相同組的基因外顯子數目比較接近。

圖3 茶樹、擬南芥SRO蛋白的系統(tǒng)進化樹

圖4 茶樹SRO基因結構分析

2.4 CsSRO基因啟動子順式元件分析

為了研究基因對各種信號因子的應答作用，用其轉錄起始位置上游2?000?bp的序列查找各類順式作用元件，發(fā)現(xiàn)有許多光信號元件（MRE、box-4、TCT-motif等22種）、生長發(fā)育相關的元件（MBST、RY-element、CAT-box等8種），還有很多激素和脅迫響應元件。重點對基因啟動子中與激素和脅迫響應相關的順式作用元件進行分析并做圖（圖5），由圖中可知，基因啟動子含有12種響應激素和脅迫的順式調控元件，主要包括脫落酸（ABRE，12個）、赤霉素（P-box，2個；GARE-motif，3個；TATC-box，2個）、茉莉酸甲酯（CGTCA-motif，7個；TGACG-motif，7個）、水楊酸（TCA-element，3個）、生長素（TGA-element，3個）等激素響應元件，還有厭氧誘導（ARE，24個）、防御和應激響應元件（TC-rich，3個）、低溫響應元件（LTR，3個）、參與干旱誘導的MYB結合位點（MBS，3個）等脅迫響應順式作用元件。這暗示了茶樹SRO家族在茶樹生長發(fā)育及多種激素和脅迫中的潛在作用。

圖5 CsSRO基因啟動子區(qū)順式元件分析

2.5 基于轉錄組數據的CsSRO基因在茶樹不同組織中的表達模式

為了挖掘家族在茶樹生長發(fā)育過程的潛在功能，從網上下載茶樹8個組織（頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖、花、果）的轉錄組，分析9個基因在茶樹8個組織中的表達模式。在組織中不表達，其他成員在各個組織均有表達，因此只對另外8個基因重點分析（圖6）。和在各個組織中的表達水平較低，而、在各個組織中均高表達。和在6個組織中較高表達，分別在花和根中的表達量最高。成熟葉和根中的表達量最高。總的來說，大多數基因在根和成熟葉中較高表達（FPKM>14），推測可能在根和葉中發(fā)揮重要生物學功能。

2.6 CsSRO基因在干旱脅迫和外源ABA處理下的表達模式

通過熒光定量技術對基因在干旱脅迫和外源ABA處理0、6、12、24、48?h后的表達水平進行分析，0?h的處理為對照（圖7）。干旱處理下，9個茶樹基因均被誘導表達，但表達水平在處理的不同時間點有一定差異。在4個時間點均被下調表達，24?h時表達量最低。的表達量在12?h時達到峰值，24?h時下降到控制水平，48?h時表達量又上升，表達量又下降。、、、、在4個時間點均以不同程度被上調表達，峰值表達量分別是0?h的4.9、3.4、2.7、398.4、27.9和5.6倍。ABA處理下，大多數都存在明顯的響應，變化趨勢不盡相同。的表達量在4個時間點的變化不顯著。、、、在4個時間點均被抑制表達。在不同時間點均被上調表達，的相對表達量在6?h時上升隨后逐漸下降到控制水平以下。和最高可上調表達3倍和1.8倍。

3 討論

SRO蛋白家族在陸地植物中高度保守[6]，其生物學功能及分子調控機制受到越來越多的關注，然而，的功能在茶樹中還是未知的。本研究從茶樹基因組中鑒定出的9個茶樹基因均具有PARP和RST等特征保守結構域，其中CsRCD4具有WWE結構域，分別起重要功能作用[14]。通過與擬南芥SRO家族進行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，家族基因中可能含有旁系同源基因，說明在長期進化過程中發(fā)生了基因重復事件[31]。在擬南芥中，根據SRO蛋白家族是否具有N端WWE結構域將其分為兩類，CsRCD1—4與具有N端WWE結構域的AtRCD1、AtSRO1聚為第Ι組，CsRCD4和AtRCD1、AtSRO1一樣同時具有PARP、RST和WWE域，CsRCD1—3缺失WWE域，但CsRCD1—3與AtRCD1、AtSRO1系統(tǒng)進化樹親緣關系更近，CsRCD1、CsRCD2和CsRCD3之間同源性也更高，這表明PARP和RST域在茶樹中比WWE域保守。CsSROs基因亞組間基序分布有一定差異，表明不同組的CsSRO基因在功能上有所差異[32]，例如，基序4僅在Ι組中發(fā)現(xiàn)，Ⅱ和Ⅲ組都缺少基序4，這表明Ι組成員較于其他類群具有特殊的功能，CsSRO1和CsSRO3還分別缺少基序1和3，這可能是在組織中不表達、強烈響應干旱脅迫的原因之一。對外顯子和內含子的研究有助于了解基因的結構和功能上的差異[33]，相同組的基因外顯子數目很接近，例如Ι組中的CsRCD1、CsRCD2和CsRCD3，Ⅱ組中的CsSRO1和CsSRO2，Ⅲ組中的CsSRO3和CsSRO4，因此，大多數基因呈現(xiàn)保守的基因結構，支持密切的進化關系。

基因在植物不同組織中的表達水平與其生長發(fā)育調控密切相關。有研究表明大部分蘋果基因在根、莖和花中的表達量較高[15]，玉米家族基因在根系的表達量顯著高于其他組織[5]。與之相似，和分別在花和根中的表達水平顯著高于其他組織，暗示可能在茶樹花器官發(fā)育發(fā)揮重要作用，在根系發(fā)育中發(fā)揮作用。在8個茶樹組織中均高表達，提示其具有重要作用，可能參與茶樹發(fā)育過程中多種生理生化的轉錄調控過程[31]。有趣的是，和均在根和成熟葉中的表達量較高。根部是植物吸收水分和礦物質的重要部位，葉片蒸騰作用造成水分損失[34]。推測可能通過影響茶樹根系吸水能力和葉片蒸騰作用，增強茶樹耐干旱能力。

注：顏色刻度表示log2轉換后的值，紅色代表高表達，藍色代表低表達

圖7 CsSROs基因在干旱脅迫和脫落酸處理下的表達分析

為了研究茶樹基因在干旱脅迫下的響應情況，本研究分別采用PEG和外源ABA處理茶樹葉片，熒光定量分析結果證實在干旱和ABA處理下均有表達且表達受到不同程度的誘導。擬南芥中，定位于細胞核的與轉錄因子DREB2A相互作用，參與植物ABA依賴的干旱反應[14]。亞細胞預測定位于細胞核的與具有較高的同源性，在干旱脅迫中上調表達，其中在ABA處理下顯著上調表達，可能具有類似的生物學功能。玉米中，和在干旱條件下顯著上調表達[5]。、在干旱處理不同時間點下最高可以分別上調4.9、3.4、2.7、398.4、27.9、5.6倍，表明這6個成員尤其是對干旱脅迫具有較高的敏感性。其中，在ABA處理不同時間點均被誘導下調表達。與茶樹相似，異位表達的蘋果降低轉基因幼苗對外源ABA的敏感，并且耐受干旱脅迫[15]，推測可能參與ABA信號途徑負調控干旱反應。在基因啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)很多與脫落酸及干旱脅迫響應調控相關的順式元件，也預示著基因家族有可能通過激素信號轉導途徑響應干旱脅迫。

本研究在茶樹全基因組范圍內鑒定獲得基因家族，并分析其結構和功能，推測基因與茶樹的生長發(fā)育和抗旱響應密切相關，為深入了解茶樹中該基因家族成員的功能提供了參考和一定的研究基礎。

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Genome-wide Identification and Expression Analysis ofGene Family in

GUO Yongchun, WANG Pengjie, CHEN Di, ZHENG Yucheng, CHEN Xuejin,YE Naixing*

College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian, Fuzhou 350002, China

(Similar to rcd one) are plant-specific gene families. In this study, 9gene family members were identified from tea tree genome by bioinformatics method and named asandrespectively. All coding proteins of the 9genes have characteristic structural domains PARP and RST, and have similar conserved motifs. The CsSRO genes were divided into 3 groups based on phylogenetic tree analysis, with the groupΙcontaining CsRCD1—4, the groupⅡcontaining CsSRO1, CsSRO2 and the group Ⅲcontaining CsSRO3—5. Gene structure analysis shows that this gene family contained 4 to 9 exons. Analysis of transcriptome data from 8 tea tree tissues shows thatmight play an important role in different developmental stages of tea plants. Mostgenes were highly expressed in roots and mature leaves. Upstream promoter region analysis found a large number of-acting elements closely related to plant development, hormones and stress response. Further expression analysis shows that 9genes were induced by drought and abscission acid treatments, suggestinggenes may be closely related to drought resistance.

,, phylogeny analysis, stress

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2019)04-392-11

2019-02-11

2019-03-26

福建省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”中國烏龍茶產業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心專項（閩教科〔2015〕75號）、國家現(xiàn)代農業(yè)（茶葉）產業(yè)技術體系建設專項資金項目（CARS-19）、福建農林大學科技創(chuàng)新專項基金項目（CXZX2016117、CXZX2017181）

郭永春，女，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種與生物技術研究方面的研究。*通信作者：ynxtea@126.com