基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記的部分湖南本土牡丹資源聚類分析

許文婷　呂長(zhǎng)平　陳夢(mèng)潔　孫田嬌　陳海霞　李炎林

摘要：對(duì)9份湖南本土牡丹資源的28個(gè)主要性狀進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)，通過R型聚類分析、Q型聚類分析與主成分分析探討其品種數(shù)量分類的標(biāo)準(zhǔn)和親緣關(guān)系。R型聚類分析的結(jié)果得出花冠橫徑與花冠縱徑、心皮數(shù)量、花朵高度相關(guān)系數(shù)均>0.9，花瓣數(shù)量與花梗長(zhǎng)（r=0.986）、瓣端形狀與雄蕊花絲顏色（r=0.934）、外花瓣輪數(shù)與花色（r=0.933），因此Q型聚類中不考慮花冠縱徑、心皮數(shù)量和花朵高度等6個(gè)性狀。主成分分析結(jié)果表明，瓣數(shù)量、花瓣大小、花冠橫徑等9個(gè)性狀的貢獻(xiàn)率較大。Q型聚類分析結(jié)果表明，根據(jù)各個(gè)主要性狀的遺傳差異將9份湖南本土牡丹資源分成兩大類：第一大類為鳳優(yōu)4號(hào)、鳳丹白、鳳丹粉、楊山牡丹、寶慶紅、鳳優(yōu)2號(hào);第二大類為鳳優(yōu)1號(hào)、鳳優(yōu)3號(hào)、鳳優(yōu)5號(hào)。綜上，可為湖南本土牡丹品種分類和親緣關(guān)系分析提供參考。

關(guān)鍵詞：牡丹;形態(tài)學(xué)標(biāo)記;R型聚類;主成分分析;Q型聚類

中圖分類號(hào)：S685.110.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0135-04

牡丹（Paeonia suffuticosa）別稱富貴花、兩百金等，屬芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）植物，是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，也是我國(guó)特有的珍貴觀賞、藥用和油用植物[1]。經(jīng)過長(zhǎng)期的人工和自然選擇，我國(guó)牡丹已經(jīng)形成了4個(gè)牡丹品種群：中原牡丹品種群、西北牡丹品種群、西南牡丹品種群、江南牡丹品種群[2]。湖南省是牡丹自然分布區(qū)之一，且湖南省牡丹屬江南牡丹品種群[3]。依據(jù)史料記載，湖南省牡丹藥用栽培有 2 000 多年歷史，觀賞栽培也有1 000多年歷史，并形成湘西北以觀賞牡丹為主和湘西南以藥用牡丹為主的2個(gè)栽培中心[4-6]。

從前人對(duì)湖南省牡丹品種資源調(diào)查結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，由于缺乏對(duì)湖南省牡丹的養(yǎng)護(hù)管理[7-9]，逐年會(huì)有部分原有品種資源遺失，同時(shí)又發(fā)現(xiàn)一些新的具有較高觀賞價(jià)值的因自然雜交產(chǎn)生的實(shí)生苗變異材料[10]。但這些品種是經(jīng)過多年多次的自然雜交而來，其來源和親緣關(guān)系不明，因此，對(duì)這些品種進(jìn)行準(zhǔn)確分類尤為重要。形態(tài)學(xué)標(biāo)記作為遺傳標(biāo)記的一種，能從表型性狀來檢測(cè)遺傳變異，是最直接也是最簡(jiǎn)便易行的方法[11]。因此，本研究運(yùn)用數(shù)量分類學(xué)對(duì)藥用牡丹資源調(diào)查中新發(fā)現(xiàn)的5個(gè)優(yōu)良單株資源和與其相關(guān)的4個(gè)湖南本土牡丹資源的28個(gè)主要性狀進(jìn)行聚類分析和主成分分析，以期探究湖南本土牡丹資源分類的等級(jí)和標(biāo)準(zhǔn)，確定新發(fā)現(xiàn)的牡丹優(yōu)良單株資源的親緣關(guān)系，為湖南本土牡丹種質(zhì)資源開發(fā)利用和耐濕熱的新品種育種提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉教學(xué)科研基地保存的9份牡丹資源（表1），植株年齡為3年。

1.2牡丹形態(tài)性狀的觀測(cè)

從2017年11月下旬到2018年4月下旬對(duì)栽植在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉教學(xué)科研基地的鳳丹白、寶慶紅、楊山牡丹、鳳丹粉和5個(gè)優(yōu)良單株，從萌芽期到盛花期以及展葉后的旺盛生長(zhǎng)季記錄觀察到的形態(tài)特征。在牡丹萌芽期，每份資源選取生長(zhǎng)健壯的10個(gè)越冬鱗芽作為觀測(cè)對(duì)象，每隔5 d觀測(cè)1次芽的生長(zhǎng)情況;待牡丹莖上葉序基本形成后，以當(dāng)年生枝基部向上第3個(gè)葉柄上的葉片為對(duì)象，每隔5 d觀測(cè)1次;在現(xiàn)蕾期每隔5 d觀測(cè)1次花蕾的性狀，直至花蕾完全綻放。在觀測(cè)日的16：00—17：00對(duì)比PAN-TONE（潘通）色卡記錄相關(guān)顏色。質(zhì)量性狀的觀測(cè)主要采用肉眼觀察，包括花期、花型、花態(tài)、花瓣基部有無色斑、色斑顏色、色斑形狀等;數(shù)量性狀的觀測(cè)主要采用卷尺和游標(biāo)卡尺，包括花梗長(zhǎng)、花冠橫徑、縱徑、花朵高度、花瓣數(shù)、復(fù)葉長(zhǎng)、復(fù)葉寬等。

1.3分類性狀的選取與編碼方法

觀測(cè)選取的形態(tài)學(xué)表型性狀包括質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀，用于分類的質(zhì)量性狀須按照牡丹品種形態(tài)性狀記載標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行整理和規(guī)范[12]，性狀的編碼（表2）按照等級(jí)數(shù)量編碼的方法進(jìn)行分級(jí)、賦值[13]，二態(tài)性狀以0和1表示，肯定狀態(tài)為1，否定狀態(tài)為0;有序多態(tài)性狀應(yīng)按從原始性狀不斷進(jìn)化的順序，取連續(xù)排列的非負(fù)整數(shù)1，2，3，…，n進(jìn)行編碼;無序多態(tài)性狀多按生物進(jìn)化順序進(jìn)行編碼。數(shù)量性狀不編碼，取平均值直接運(yùn)算。

1.4數(shù)據(jù)處理

因?yàn)閿?shù)據(jù)量綱不同會(huì)影響聚類分析的結(jié)果，因此分析之前先運(yùn)用SPSS 18.0對(duì)原始數(shù)值進(jìn)行預(yù)處理（標(biāo)準(zhǔn)化）。然后對(duì)牡丹的28個(gè)性狀進(jìn)行R型聚類分析，度量標(biāo)準(zhǔn)選用Pearson系數(shù)，使差異性大的變量分離開來，得到性狀指標(biāo)聚類樹形圖（圖1）。從圖中表示的相似變量中選擇具有代表性的變量參與其他分析，減少分析的變量個(gè)數(shù)。根據(jù)R型聚類結(jié)果對(duì)牡丹資源進(jìn)行Q型聚類分析，利用歐氏平方距離系數(shù)進(jìn)行測(cè)度，得出分類結(jié)果樹形圖（圖2）。同時(shí)采用主成分分析，通過降維的方法將多個(gè)指標(biāo)簡(jiǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)，使這幾個(gè)少數(shù)綜合指標(biāo)可以反映原來所有指標(biāo)的信息[14]。全部數(shù)學(xué)運(yùn)算均在Microsoft Excel 2013和SPSS 18.0軟件上完成。

2結(jié)果與分析

2.1R型聚類分析的結(jié)果及分析

R型聚類分析是對(duì)樣本的性狀進(jìn)行分類，使具有共同特征的性狀聚集在一起，以便選出具有代表性的性狀進(jìn)行分析，減少分析性狀的個(gè)數(shù)，又能對(duì)后續(xù)Q型聚類分析選取性狀的合理性進(jìn)行驗(yàn)證[15]。

由圖1可知，分析的大部分性狀相關(guān)性不高，僅有少數(shù)性狀相關(guān)性比較高?；ü跈M徑與花冠縱徑、心皮數(shù)量、花朵高度相關(guān)系數(shù)均大于0.9，花瓣數(shù)量與花梗長(zhǎng)（r=0.986）、瓣端形狀與雄蕊花絲顏色（r=0.934）、外花瓣輪數(shù)與花色（r=0.933）的相關(guān)性較大。2個(gè)變量的相關(guān)系數(shù)接近1或者-1，說明2個(gè)變量可互相代替。但花瓣橫徑、花色、花瓣數(shù)量與瓣端形狀區(qū)別不同品種較其他相關(guān)性高的性狀明顯，所以相關(guān)性高的性狀中保留這4個(gè)性狀參與Q型聚類分析的運(yùn)算，其他性狀剔除，不會(huì)影響聚類分析結(jié)果。

2.2主成分分析的結(jié)果及分析

對(duì)牡丹的22個(gè)主要性狀進(jìn)行主成分分析，由表3可知，前4個(gè)主成分的總貢獻(xiàn)率為89.894%。第1主成分的貢獻(xiàn)率為40.043%，其中特征向量值比較大的性狀是花瓣數(shù)量、花瓣大小、花冠橫徑、花色、鱗芽寬和瓣端形狀，其特征值均在0.741及以上，主要反映的是花和芽的情況。第2主成分的貢獻(xiàn)率為24.066%，其中特征向量值比較大的性狀的是復(fù)葉葉柄長(zhǎng)、復(fù)葉長(zhǎng)、復(fù)葉寬、復(fù)葉葉柄粗、當(dāng)年生枝長(zhǎng)和當(dāng)年生枝粗，其特征值均在0.674及以上，主要反映的是復(fù)葉和當(dāng)年生主枝的情況。第3主成分的貢獻(xiàn)率為13.327%，其中特征向量值比較大的性狀的是葉形、株型，其特征值均在0.553及以上，主要反映的是葉形和株型的情況。第4主成分的貢獻(xiàn)率為 12.458%，其中特征向量值比較大的性狀是花瓣基部有無色斑、色斑顏色和色斑形狀，其特征值均在0.596及以上，主要反映的是花瓣基部的色斑情況。

2.3Q型聚類分析的結(jié)果及分析

根據(jù)Q型聚類分析樹形（圖2）所示，在等級(jí)結(jié)合線L1（D=23.0）處，9個(gè)品種被分為兩大類，第一大類為鳳優(yōu)4號(hào)、鳳丹白、鳳丹粉、楊山牡丹、鳳丹粉、寶慶紅、鳳優(yōu)2號(hào)，為鱗芽偏大、復(fù)葉較大、當(dāng)年生主枝較長(zhǎng)的品種類群。第二大類為鳳優(yōu)1號(hào)、鳳優(yōu)3號(hào)、鳳優(yōu)5號(hào)，葉形均為長(zhǎng)卵葉、鱗芽偏小、復(fù)葉較小、當(dāng)年生主枝較短的品種類群。在等級(jí)結(jié)合線L2（D=17.2）處，第一大類可進(jìn)一步劃分為2個(gè)亞類，第1個(gè)亞類為寶慶紅，第2個(gè)亞類為鳳優(yōu)4號(hào)、鳳丹白、鳳丹粉、楊山牡丹、鳳優(yōu)2號(hào)，寶慶紅與第2個(gè)亞類的品種相比較，其花期最晚、植株矮小、萌蘗性強(qiáng)、花朵橫徑和花瓣大小均較小、復(fù)葉長(zhǎng)也較短且葉型偏圓;第2個(gè)亞類可以進(jìn)一步分為鳳優(yōu)2號(hào)單獨(dú)一類，其與鳳優(yōu)4號(hào)、鳳丹白、鳳丹粉、楊山牡丹相比較，外花瓣輪數(shù)為4輪的荷花型、花瓣數(shù)量較多、花瓣較大、株型較高大。鳳優(yōu)4號(hào)、鳳丹白、鳳丹粉、楊山牡丹為2～3輪的單瓣型，花瓣數(shù)量相似、花色除鳳丹粉外均為白色、鱗芽形狀均為長(zhǎng)卵形、復(fù)葉長(zhǎng)、寬較相似。第二大類可進(jìn)一步劃分，主要根據(jù)鳳優(yōu)1號(hào)的復(fù)葉長(zhǎng)、寬和當(dāng)年生主枝長(zhǎng)較鳳優(yōu)3號(hào)和鳳優(yōu)5號(hào)的指標(biāo)大。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在選取形態(tài)學(xué)表型性狀時(shí)，考慮了前人在牡丹數(shù)量分類研究中對(duì)品種分類影響較大的重要指標(biāo)。如成仿云等提出的花色和花型是牡丹最主要的2個(gè)形態(tài)特征，但因本試驗(yàn)的牡丹品種花瓣輪數(shù)多為2～3輪的單瓣型，只有鳳優(yōu)2號(hào)的花瓣為4輪的荷花型，不排除是栽培條件的影響，還需后期的觀察，故不參與本次試驗(yàn)的數(shù)量分類[12]。花色是牡丹新品種選育中最直觀的觀測(cè)指標(biāo)，根據(jù)此試驗(yàn)中主成分分析的結(jié)果，可將其作為湖南本土牡丹數(shù)量分類的三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，張亮等認(rèn)為由于同一植株（品種）常有多種花型并存的現(xiàn)象，因此將其作為紫斑牡丹品種分類的三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]。而且因?yàn)樵囼?yàn)材料為調(diào)查意外發(fā)現(xiàn)的新品種，引種后受地理位置和氣候的影響，不能保證著花率和結(jié)實(shí)率，所以也沒有選取著花率和結(jié)實(shí)率。前[CM（25]人的研究結(jié)果將結(jié)實(shí)率作為牡丹數(shù)量分類的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，與此試驗(yàn)分析得出的花瓣數(shù)量和花朵大小的貢獻(xiàn)率較大不同，這還有待進(jìn)一步研究。

從各性狀的主成分分析得出花瓣數(shù)量、花瓣大小、花冠橫徑、花色、復(fù)葉長(zhǎng)、復(fù)葉寬、當(dāng)年生枝長(zhǎng)、當(dāng)年生枝粗和株型的貢獻(xiàn)率在22個(gè)性狀指標(biāo)中較大，這些性狀可作為同地區(qū)、親緣關(guān)系較近的牡丹品種數(shù)量分類和新品種選育選擇的主要參考指標(biāo)。此外由本試驗(yàn)9個(gè)品種的聚類分析可得出，楊山牡丹與鳳丹白、鳳丹粉同為一個(gè)亞類，親緣關(guān)系比較近，也符合前人認(rèn)為鳳丹白、鳳丹粉為楊山牡丹的栽培品種的結(jié)論。而寶慶紅屬于另外一個(gè)亞類，這一結(jié)果與張旻桓等[17]和鐘麗凡等[18]用ISSR分子標(biāo)記得出的結(jié)論相同，而另外5個(gè)新發(fā)現(xiàn)的單株資源分屬于2個(gè)不同的大類，說明這5個(gè)單株資源之間很可能不是同一個(gè)品種，其遺傳性狀差異相對(duì)較大，可利用其遺傳性狀差異產(chǎn)生的較高的觀賞價(jià)值，選育湖南本土的優(yōu)良新品種。雖然聚類分析中性狀指標(biāo)均按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行量化，一定程度上避免了人為主觀的誤差影響，使分類由定性分析變?yōu)槎糠治鯷19]，但是植物的形態(tài)性狀容易受外部環(huán)境的影響，還應(yīng)該綜合分子標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)等方法才能更加準(zhǔn)確地鑒定牡丹品種之間的親緣關(guān)系。

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