白茶水提物通過誘導(dǎo)凋亡抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402增殖

劉博，黃嘉璐，劉立躍

福建省寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，352100

白茶（White tea, WT） 是我國的一種特種茶，主要產(chǎn)于福建省福鼎、政和、松溪和建陽等縣，其中福鼎是世界白茶的發(fā)源地，也是中國白茶的主要出口基地。白茶是一種微發(fā)酵茶，其加工工藝簡單，只包括萎凋和干燥兩道工序，既不破壞酶的活性，又不促進(jìn)氧化作用，因其成品茶多為芽頭，滿披白毫而得名。白茶不僅具有其他茶類含有的茶多酚、兒茶素、維生素、生物堿、氨基酸及揮發(fā)性物質(zhì)等成分[1-2]，而且其茶多酚和兒茶素等有效成分的含量均高于紅茶和黑茶等發(fā)酵茶類[3-4]。白茶和綠茶中的各有效成分含量相近，兩者都具有較高含量的兒茶素，兒茶素是茶類發(fā)揮保健作用的主要活性成分，因而普遍認(rèn)為這兩類茶具有更好的保健作用[5-6]。

國內(nèi)外已有的研究表明，不同類別的茶葉（包括白茶、紅茶、烏龍茶、綠茶）、不同茶葉組分（如熱水提取液、茶多酚化合物等）對多種腫瘤（肺癌、胃癌、皮膚癌、乳腺癌、肝癌和食道癌等）均有抑制作用[7-8]。阻礙腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是綠茶及其提取物抑制腫瘤生長的重要途徑[9-10]。然而，有關(guān)白茶對腫瘤細(xì)胞抑制作用的研究還很少，白茶或其提取物是如何抑制腫瘤細(xì)胞增殖的問題有待研究。

本研究以肝癌細(xì)胞BEL-7402 株為試驗(yàn)對象，以 白 茶 水 提 物 （White tea aqueous extract, WTAE）為研究材料，采用DAPI 染色法、TUNEL 法和Caspase-3 活性檢測法等探究WTAE能否導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡；利用Real-time PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

BEL-7402 細(xì)胞購自ATCC 在中國的代理公司；1640培養(yǎng)液為GIBCO公司生產(chǎn)；胎牛血清購自杭州四季青公司；雙抗（青霉素和鏈霉素）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DAPI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒均購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol購自TaKaRa公司；Real-time PCR 試劑盒購自Thermo 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas 公司；各兒茶素組分等的標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所。

2.白茶水提物的準(zhǔn)備

白茶（白毫銀針）購自寧德市福鼎某茶葉公司。將2 g 白茶粉放入56℃的100 mL 去離子水中浸泡1 h；取茶湯經(jīng)孔徑為0.45 μm 的濾器過濾后凍干備用。

3.白茶水提物成分分析

采用液相色譜法檢測白茶水提物和白茶中咖啡堿、沒食子酸（GA）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和兒茶素沒食子酸酯（CG）等成分的含量。具體方法參照國標(biāo)《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）。色譜柱為C18，用標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，各成分含量按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

4.細(xì)胞培養(yǎng)和處理

BEL-7402 細(xì)胞采用體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長成80%融合時(shí)，在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.1%的白茶水提物處理細(xì)胞（參照前期研究結(jié)果），同時(shí)以不含白茶水提物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組。培養(yǎng)不同的時(shí)間后收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測。

5.DAPI染色法檢測細(xì)胞核變化

BEL-7402 細(xì)胞接種于24 孔板中后，以含0.1%的白茶水提物的培養(yǎng)液培養(yǎng)8、16、24、48 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS 洗滌1～2 遍，經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min后，DAPI染液染色15 min，再用甲醇漂洗1 次，滴加適量抗熒光淬滅劑后，熒光顯微鏡（Nikon ELIPSE Ts2R）觀察結(jié)果并拍照。

6.TUNEL檢測法

采用與前述相同的培養(yǎng)方法培養(yǎng)BEL-7402細(xì)胞8、16、24、48 h 后，棄培養(yǎng)液，按TUNEL 檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂情況，具體操作如下： PBS 潤洗1～2 遍；細(xì)胞固定液固定15 min；PBST潤洗3遍；滴加適量的TUNEL檢測液，室溫避光孵育1 h；PBS 洗滌3 次；滴加適量抗淬滅劑，熒光顯微鏡（Nikon ELIPSE Ts2R）下觀察結(jié)果并拍照。

7.Caspase-3活性檢測

待BEL-7402細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，以質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.1%的白茶水提物處理細(xì)胞8、16、24、36、48 h 后收集細(xì)胞，按照Caspase-3 活性檢測試劑盒說明書檢測Caspase-3的活性。具體操作如下：首先采用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測樣品中的蛋白濃度；再用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；將收集的細(xì)胞裂解后，離心取上清加入Ac-DEVD-pNA檢測試劑，37℃反應(yīng)2 h后，酶標(biāo)儀(Thermo Variokan LUX)讀取OD值；結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白濃度檢測結(jié)果計(jì)算樣品中Caspase-3的活性。

8.Real-time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)p53和p21的表達(dá)水平

采用Real-time PCR 檢測細(xì)胞內(nèi)與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。具體操作如下：首先用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 遍，盡量去除殘留的PBS 后加入TRIzoL裂解細(xì)胞并收集樣品，按照試劑盒說明書提取總RNA，再用DNA 酶去除殘留的基因組DNA，采用多功能酶標(biāo)檢測樣品的OD260∶OD280，分析RNA 純度后，取2 μg 的總RNA 用于反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA（cDNA 第一鏈合成試劑盒為Fermentas 公司生產(chǎn)，具體操作按照試劑盒說明書）。然后各取1 μL cDNA 為模板，進(jìn)行Realtime PCR定量分析細(xì)胞內(nèi)p53和p21表達(dá)水平，所用引物序列如表1（根據(jù)GenBank所提供的各基因的CDNA序列設(shè)計(jì)），內(nèi)參為GAPDH。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用雙因子方差分析（Two-way ANOVA）進(jìn)行各試驗(yàn)組之間的差異分析，結(jié)合Dunnett-t 檢驗(yàn)法分析比較各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的差異。

二、結(jié)果與分析

1.白茶和白茶水提物中咖啡堿和各兒茶素組分含量

按照國標(biāo)法測定WTAE 的提取率為（42.1±4.8）mg/g（表2）。 采用液相色譜法測定WT 和WTAE 中咖啡堿和各兒茶素組分的含量，結(jié)果如表2 所示。WTAE 中各成分含量均高于WT。此外，本試驗(yàn)結(jié)果和已有的報(bào)道存在差異。

2.細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化

BEL-7402 細(xì)胞經(jīng)WTAE 處理8、16、24、48 h后，采用DAPI檢測試劑盒檢測細(xì)胞核的形態(tài)變化。結(jié)果如圖1 所示，在WTAE 作用16 h 后，BEL-7402 細(xì)胞的細(xì)胞核濃染，細(xì)胞核開始濃縮；作用24 h 后，細(xì)胞核濃縮較明顯，作用48 h 后，核進(jìn)一步濃縮，顯示典型凋亡細(xì)胞的核特征。由以上試驗(yàn)結(jié)果可知，WTAE能導(dǎo)致BEL-7402出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。

3.WTAE能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)染色體DNA的降解

采用TUNEL 法檢測白茶作用下BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)染色體DNA 是否發(fā)生降解。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)經(jīng)WTAE處理16 h后，經(jīng)TUNEL標(biāo)記細(xì)胞核出現(xiàn)較弱的熒光信號；24 h熒光信號較為明顯；48 h后信號更為明顯，而各對照組的細(xì)胞未見任何標(biāo)記信號。因此認(rèn)為，WTAE能導(dǎo)致BEL-7402細(xì)胞的染色體DNA發(fā)生降解。

4.WTAE對細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性的影響

BEL-7402 細(xì)胞用含WTAE 的培養(yǎng)液培養(yǎng)8、16、24、36、48 h 后，收集細(xì)胞采用分光光度法檢測細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3 的活化水平。結(jié)果如圖3所示，經(jīng)WTAE 作用8 h 后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 的活性水平明顯升高，且在24 h 活性最高；36 h 后活性下降，但也明顯高于對照組。 Caspase-3 的活性變化符合凋亡細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 活性變化規(guī)律。

表1 引物序列

圖1 DAPI染色法檢測細(xì)胞核的形態(tài)變化（400×）

表2 白茶和白茶水提物成分分析mg/g

圖2 TUNEL法檢測染色體DNA斷裂情況（400×）

5.WTAE對p53和p21表達(dá)水平的影響

采用Real-time PCR 檢測WTAE 處理組和對照組細(xì)胞內(nèi)p53和p21表達(dá)水平。從試驗(yàn)結(jié)果（圖4）可以看出，在WTAE 作用下，BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)p53 和p21 的mRNA 水平明顯升高，與對照組相比，差異顯著，說明WTAE能使細(xì)胞內(nèi)p53和p21表達(dá)水平顯著升高。

圖3 BEL-7402細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性變化

圖4 Real-time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)p53和p21的表達(dá)水平

三、討論

福建閩東所產(chǎn)的白茶為非發(fā)酵茶類，其加工過程缺乏發(fā)酵、烘焙以及前期的萎凋等工序，這些工序會使茶葉中的兒茶素轉(zhuǎn)化成茶黃素和其他復(fù)合多酚[11]。因此，白茶中有較高含量的EGCG等具有抗氧化作用的多酚類物質(zhì)[12]，這些物質(zhì)是茶類發(fā)揮保健作用的主要活性成分。由于不同的研究中所采用的白茶的茶葉種類、加工和提取條件等存在差異，因而不同的文獻(xiàn)中所報(bào)道的白茶或其提取物中的有效成分含量存在差異。盡管本試驗(yàn)分析白茶水提物和白茶的有效成分結(jié)果和已有的文獻(xiàn)報(bào)道存在差異，但也證明了白茶中有較高含量的兒茶素。前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，WTAE 能明顯抑制Hela細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞的增殖，而且WTAE所導(dǎo)致的死亡細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，不能被臺盼藍(lán)著色。因此我們懷疑WTAE 所導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖抑制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。在本試驗(yàn)中，DAPI染色試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在白茶水提物的作用下，BEL-7402的細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的濃縮，并且TUNEL法檢測亦顯示在WTAE 作用下，BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)染色體DNA 出現(xiàn)斷裂。此外，WTAE 還能使細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性顯著升高，以上現(xiàn)象是細(xì)胞凋亡發(fā)生的典型特征，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是白茶水提物實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞增殖抑制的主要方式。

p53 和p21 是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的重要信號蛋白[13-14]。當(dāng)細(xì)胞遭遇異常情況如DNA受損時(shí)，p53表達(dá)水平和活化水平會顯著升高，一方面p53 可以阻斷細(xì)胞分裂周期導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻，另一方面p53可以充當(dāng)促凋亡蛋白因子（如p21）的轉(zhuǎn)錄因子，提高其表達(dá)水平，引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[15-17]。定量PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)WTAE 作用下，BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)p53 和p21 的表達(dá)水平均有升高，說明WTAE 所引起的腫瘤細(xì)胞凋亡與p21 和p53有關(guān)。但是WTAE是如何活化腫瘤細(xì)胞內(nèi)與凋亡相關(guān)的信號通路來影響p53 等凋亡相關(guān)蛋白因子的表達(dá)水平的，有待進(jìn)一步研究證明。

本項(xiàng)研究證明了WTAE 能通過誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡而抑制其增殖，為白茶的抗腫瘤保健作用提供重要的理論依據(jù)，并為闡明WTAE 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。